[發(fā)明專利]D二聚體檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410704446.2
• 申請(qǐng)日: 2014-11-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104730245A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-06-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王有志;王鵬浩;蔡榮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 威海紐普生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/577
• 分類號(hào): G01N33/577;G01N33/558;G01N33/533;C07K16/18
• 代理公司: 威海科星專利事務(wù)所 37202
• 代理人: 初姣姣

1.一種D二聚體檢測(cè)試劑盒，設(shè)有試紙卡，其特征在于所述試紙卡由下至上依次設(shè)有：PVC板、樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，其中結(jié)合墊上吸附有稀土熒光微球標(biāo)記的D二聚體單克隆抗體，所述稀土熒光微球的直徑為60-120nm，稀土熒光微球摻雜稀土鑭系元素，在基態(tài)下穩(wěn)定，在340-380nm的激發(fā)光源作用下發(fā)射出波長(zhǎng)范圍在540-600nm的熒光；所述單克隆抗體為純化后混合的單克隆抗體，來(lái)源于針對(duì)2-6個(gè)不同的D二聚體抗原表位的單克隆抗體細(xì)胞株。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種D二聚體檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述結(jié)合墊的稀土熒光微球的直徑是70-90nm；所述稀土熒光微球摻雜有稀土鑭系元素。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種D二聚體檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述稀土熒光微球摻雜稀土絡(luò)合物；結(jié)合墊上稀土熒光微球標(biāo)記的抗體來(lái)源于針對(duì)2個(gè)不同抗原表位的單克隆細(xì)胞細(xì)胞株。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種D二聚體質(zhì)檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述結(jié)合墊采用如下步驟制得：將玻璃纖維膜浸泡于150mM?Tris-HCL處理液中（含1.0%?Triton?X-100，2.5%BSA，pH7.4），4℃浸泡4小時(shí)，然后取出37℃烘箱烘干4小時(shí)，備用，將玻璃纖維膜在Bio-DotXYZ3050三維噴點(diǎn)平臺(tái)上，用Bio-Jet?Quanti300非接觸式微定量噴頭將稀土熒光微球標(biāo)記的D二聚體單克隆抗體噴到玻璃纖維膜，37℃烘干1小時(shí)后制得。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種D二聚體質(zhì)檢測(cè)試劑盒，其特征在于結(jié)合墊上的所述稀土熒光微球標(biāo)記的D二聚體單克隆抗體采用如下步驟制得：

步驟1：?jiǎn)慰寺】贵w細(xì)胞株的獲得：用D二聚體純品免疫小鼠，采用標(biāo)準(zhǔn)的單克隆抗體制備方法制備特異性高親和力的單克隆抗體細(xì)胞株，對(duì)所獲得的單抗細(xì)胞株進(jìn)行配對(duì)篩選，根據(jù)配對(duì)結(jié)果和親和力數(shù)據(jù)優(yōu)選出用于試劑盒的單抗細(xì)胞株；

步驟2：?jiǎn)慰寺】贵w的制備：采用標(biāo)準(zhǔn)的腹水生產(chǎn)工藝制備并純化D二聚體單克隆抗體，分裝后保存于-20℃?zhèn)溆茫?/p>

步驟3：稀土熒光微球的醛基化：取5mg稀土熒光微球，用20mM，pH9.5的碳酸鹽緩沖液，采用離心法洗滌3遍，離心速度為12000rpm，時(shí)間為5分鐘，最后重懸于100μl的上述碳酸鹽緩沖液中，加入500μl醛基化的葡聚糖，混勻，室溫下暗反應(yīng)4小時(shí)，采用同樣的離心法洗滌和重懸到100μl的上述碳酸鹽緩沖液中，置于4℃?zhèn)溆茫?!-- SIPO -->

步驟4：稀土熒光微球標(biāo)記的D二聚體單克隆抗體的制備：選取來(lái)自2個(gè)不同抗原表位的單克隆細(xì)胞細(xì)胞株的單克隆抗體，按照質(zhì)量比1:1將2mg?D二聚體單克隆抗體用上述碳酸鹽緩沖液于4℃透析過(guò)夜，然后與上述醛基化的稀土熒光微球混合，4℃反應(yīng)過(guò)夜；然后，加入硼氫化鈉至終濃度5mM，4℃反應(yīng)4小時(shí)；再加入等體積的封閉液（50mM?Tris-HCL，pH7.4，含2%BSA，5%蔗糖），4℃封閉過(guò)夜；然后用50mM?Tris-HCL，pH7.4的緩沖液采用離心法洗滌3遍，重懸于100μl的50mM?Tris-HCL緩沖液中（含1.2%NaCL，0.5%BSA，0.1%Tween?20），4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種D二聚體質(zhì)檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述包被有檢測(cè)線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜通過(guò)以下步驟制得：

步驟1：采用與結(jié)合墊上所用D二聚體單克隆抗體細(xì)胞株不同的細(xì)胞株，采用標(biāo)準(zhǔn)的腹水生產(chǎn)工藝制備并純化D二聚體單克隆抗體，保存于-20℃?zhèn)溆茫?/p>

步驟2：分別用包被稀釋液將D二聚體單克隆抗體和羊抗小鼠IgG抗體調(diào)整濃度到1-5mg/ml，膜液量為1-2μl/cm，將它們分別作為檢測(cè)線和質(zhì)控線平行噴灑于硝酸纖維素膜上進(jìn)行包被，檢測(cè)線和質(zhì)控線間隔為3-7mm，然后置于烘箱中，37℃烘干2小時(shí)。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種D二聚體質(zhì)檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述樣品墊通過(guò)以下步驟制得：將玻璃纖維膜浸泡于含有1.0%Triton?X-100，2.5%?BSA，0.15M?Tris緩沖液，pH7.5的處理液中，于4℃浸泡4個(gè)小時(shí)，然后置于烘箱中，37℃烘干2小時(shí)。

8.一種利用如權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述試劑盒實(shí)現(xiàn)的D二聚體檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟：

步驟1：將檢測(cè)試劑及樣本平衡至室溫，取出試紙卡，平放；

步驟2：?精確吸取10μl血清樣本，樣本為全血時(shí)吸取20μl樣本，加入到樣本孔中，再立即在下部的緩沖液孔中加入150μL樣本稀釋液，樣本稀釋液采用生理鹽水或PBS，15-30分鐘內(nèi)用熒光免疫層析分析儀定量判定結(jié)果；

步驟3：設(shè)置好熒光免疫層析分析儀的相關(guān)參數(shù)后，將試紙卡放入倉(cāng)內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，儀器將顯示出樣品濃度的定量測(cè)定結(jié)果，所述熒光免疫層析分析儀是一種光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，對(duì)D二聚體的檢測(cè)范圍為0.1-10mg/L。