[發(fā)明專利]一種高產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖大腸桿菌的構(gòu)建及應用方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410702685.4
• 申請日: 2015-08-04
• 公開（公告）號: CN104498517A
• 公開（公告）日: 2015-07-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 魏哲
• 申請（專利權(quán)）人: 濱州市金朗生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12P19/26;C12R1/19
• 代理公司: 淄博佳和專利代理事務所 37223
• 代理人: 張雯

技術(shù)領(lǐng)域

一種高產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖大腸桿菌的構(gòu)建及應用方法，屬于遺傳工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

N-乙酰氨基葡萄糖是一種葡萄糖的衍生物，在人體內(nèi)具有多種生理功能，主要作為軟骨、關(guān)節(jié)處的潤滑液的主要成分而對骨關(guān)節(jié)的健康起著十分重要的作用。通過補充外源的氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖對于治療中老年關(guān)節(jié)疾病，緩解關(guān)節(jié)疼痛在歐美國家已作為常用的方法而得到廣泛的應用。此外，N-乙酰氨基葡萄糖還廣泛應用于嬰兒食品添加、化妝品和飼料添加等方面，用途十分廣泛。

目前N-乙酰氨基葡萄糖的生產(chǎn)是通過氨基葡萄糖和乙酸酐經(jīng)化學縮合反應而成，其主要原料氨基葡萄糖主要是通過用鹽酸或硫酸水解蝦蟹外殼而生產(chǎn)得到。在氨基葡萄糖的生產(chǎn)過程中，會產(chǎn)生大量的含鹽酸（或硫酸）乙酸的工業(yè)廢水，給環(huán)境帶來很大的壓力。因此利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖成為國內(nèi)外近幾年研究的熱點。

大腸桿菌以其培養(yǎng)簡單，遺傳操作成熟，而被用作多種發(fā)酵產(chǎn)品的首選宿主。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的菌種改造通常根據(jù)大腸桿菌現(xiàn)有的氨基葡萄糖相關(guān)代謝途徑，利用代謝工程進行修飾改造，以實現(xiàn)能利用簡單的葡萄糖或甘油等碳源，經(jīng)在大腸桿菌體內(nèi)多步酶促反應，最終合成N-乙酰氨基葡萄糖。目前國內(nèi)外構(gòu)建N-乙酰氨基葡萄糖生產(chǎn)菌株一般都通過引入6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶到大腸桿菌中表達，從而將體內(nèi)代謝生成的6-磷酸氨基葡萄糖合成為N-乙酰-6-磷酸氨基葡萄糖，進而脫去磷酸根，最終形成N-乙酰氨基葡萄糖。本發(fā)明嘗試通過引入不同于現(xiàn)有公開的技術(shù)手段的酶在大腸桿菌中表達，架構(gòu)不同的代謝途徑，并實現(xiàn)在大腸桿菌中同樣高產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的目的。另外，現(xiàn)有N-乙酰氨基葡萄糖生產(chǎn)的大腸桿菌菌株中，為了阻止N-乙酰氨基葡萄糖及其中間產(chǎn)物在體內(nèi)的回流和降解，通過敲除大腸桿菌中nagDCABE基因簇來實現(xiàn)，本發(fā)明中只敲除nagABE三個基因，保留了其中的nagDC兩個基因，以達到盡量避免對大腸桿菌體內(nèi)基因的過多改動和敲除且能同樣實現(xiàn)阻止N-乙酰氨基葡萄糖及其中間產(chǎn)物在體內(nèi)的回流和降解的目的。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種高產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖大腸桿菌的構(gòu)建及應用方法，該高產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖大腸桿菌可通過RED重組實現(xiàn)基因的敲除進而達到代謝途徑的阻斷，通過外源基因表達架構(gòu)起新的代謝途徑。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：該高產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖大腸桿菌，所述大腸桿菌是通過將編碼氨基葡萄糖乙酰化酶基因和編碼6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因?qū)氪竽c桿菌過量表達，并敲除大腸桿菌中的N-乙酰氨基葡萄糖及其中間產(chǎn)物分解代謝和向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運的一系列酶構(gòu)建而成。

所述氨基葡萄糖乙酰化酶是能催化氨基葡萄糖和乙酰輔酶A生成N-乙酰氨基葡萄糖的酶。

所述氨基葡萄糖乙酰化酶來源于丙酮丁醇梭菌（Clostridiumacetobutylicum）或能表達相同功能酶的微生物；所述氨基葡萄糖乙酰化酶的基因獲得是根據(jù)GenBank?No.?AE001437.1中的CA_C0184基因序列全基因合成，或利用丙酮丁醇梭菌的基因組DNA為模板通過PCR擴增獲得，或采用過類似手段從其他生物體獲得。

所述6-磷酸氨基葡萄糖合成酶是能催化6-磷酸果糖和谷氨酰胺生成6-磷酸氨基葡萄糖的酶。

所述6-磷酸氨基葡萄糖合成酶來源于大腸桿菌或具有相同功能酶的微生物；6-磷酸氨基葡萄糖合成酶的基因獲得可根據(jù)GenBank?No.NC_007779的大腸桿菌W3110基因組序列，經(jīng)全基因合成得到，或利用大腸桿菌基因組DNA為模板通過PCR擴增獲得。

所述大腸桿菌中的N-乙酰氨基葡萄糖及其中間產(chǎn)物分解代謝和向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運的一系列酶包括N-乙酰-6-磷酸氨基葡萄糖脫乙酰酶，6-磷酸氨基葡萄糖脫氨酶，N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白和甘露糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。

所述N-乙酰-6-磷酸氨基葡萄糖脫乙酰酶由nagA基因編碼，6-磷酸氨基葡萄糖脫氨酶由nagB基因編碼，N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白由nagE基因編碼，甘露糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)由manXYZ基因簇編碼。