[發明專利]豬H11位點的DNA片段及其應用

有效

• 申請號: 201410697384.7
• 申請日: 2014-11-27
• 公開（公告）號: CN104498481A
• 公開（公告）日: 2015-04-08
• 發明（設計）人: 李奎;阮進學;楊述林;李和剛;牟玉蓮;吳添文;魏景亮;徐奎;黃雷;周榮;劉楠
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/85
• 代理公司: 北京市京大律師事務所11321
• 代理人: 王凝;張波

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及能被定點插入的豬H11位點的DNA片段及其應用。

背景技術

基因修飾主要是指利用生物化學方法修改DNA序列，將目的基因片段導入宿主細胞內，或者將特定基因片段從基因組中刪除，從而達到改變宿主細胞基因型或者使得原有基因型得到加強的作用。基因修飾目前已經廣泛應用于人類生活的各個領域，例如，在醫學上，可以利用基因修飾的方法抑制某些病毒類宿主細胞內的病毒復制，從而達到治療的目的；在農業上，利用基因修飾的方法，人們已經成功地改變了農作物和畜禽的生產特性，從而達到改良以及傳播優良品種的目的。

在基因修飾的過程中，通常需要進行目標基因的表達，那么就需要有一個載體去容納你要的目標基因。而DNA編碼密碼子是3個一個。外源目標基因不能隨便插入，否則不能正確表達，還會把原有的順序弄亂，造成基因重排。插入位點就是可以插入基因的位點，在它那里插入外源基因，不會改變原有質粒的復制及表達，還能使自身有正常表達的機會。目前，使用較多的插入位點是Ros26位點，但是該位點為一個基因，其啟動子為全身性廣譜表達，難以做到組織特異性表達，因此需尋求一種更適宜的插入位點。

2010年，斯坦福大學的Simon?Hippenmeyer及其研究團隊在小鼠的第11號染色體上分離并鑒定出了一個良好的基因插入位點，命名為hipp11位點，簡稱H11位點。H11位點位于Eif4enif1與Drg1兩個基因的間隙，與Eif4enif1基因的19號外顯子和Drg1基因的9號外顯子相鄰，大小約5kb。H11位點由于位于兩個基因之間，因此安全性較高，無基因沉默效應，具有廣譜的細胞表達活性。實驗證實Hipp11位點定點基因修飾的小鼠與野生型小鼠生長發育無區別。此外，H11位點由于其位于兩基因之間，并且不存在啟動子，所以可以選擇實驗所需的啟動子完成目的基因的時空特異性表達，更好的達到任務目標。如果在豬的基因組中定位hipp11這樣安全有效的基因修飾位點，將有利于穩定轉基因豬培育的技術體系。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術不足提供一個供基因插入的豬H11位點。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

所述的豬H11位點的核苷酸序列，如序列表中的序列1所示。

進一步的，上述的豬H11位點的核苷酸序列，如序列表中的序列2所示。

可進一步的，上述的豬H11位點的核苷酸序列，如序列表中的序列3所示。

本發明的另一個目的是將上述基因位點用于構建豬定點突變庫上。

本發明的再一個目的是提供一種含有上述豬H11位點序列的試劑盒。

本發明提供的豬H11基因位點由于位于兩個基因之間，并且不存在啟動子，所以可以選擇實驗所需的啟動子完成目的基因的時空特異性表達，更好的完成目的基因的定點插入。此外，在該位點插入基因安全性高，無基因沉默效應，具有廣譜的細胞表達活性。在豬的基因組中定位H11這樣安全有效的基因修飾位點，通過在細胞或個體水平上對豬H11基因進行敲除或修飾，以構建豬H11基因突變庫,為培育優良品系的豬提供前期技術支持。

附圖說明

圖1為測序檢測分析酶切載體結果圖；

圖2為利用CRISPR/cas9靶向切割系統構建的綠色熒光蛋白定點插入豬H11位點后細胞PCR擴增鑒定結果圖；以及

圖3A和圖3B為陽性克隆的熒光激發圖；其中圖3A為可見光下的細胞顯微觀察圖，圖3B為紫外光下的細胞顯微觀察圖。

具體實施方式

以下實施例用于進一步說明本發明，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的前提下，對本發明所作的修飾或者替換，均屬于本發明的范疇。

如背景技術中所提到的，在培育豬的優良品種時，主要采用隨機整合的方式使外源基因隨機插入豬基因組中，為后續分析帶來了麻煩，為了克服上述缺陷，本發明提供了一種能定點插入的位點序列，利用該位點可構建該位點的切割系統以及定點插入的打靶載體系統，該方法操作簡單，同時能讓外源基因穩定在H11表達，為轉基因搭建了穩定的平臺。

下面將結合具體的實施例來說明本發明的有益效果。