[發明專利]一種快速高通量的瘧原蟲檢測方法

在審

• 申請號: 201410697132.4
• 申請日: 2014-11-26
• 公開（公告）號: CN104561268A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發明（設計）人: 田楨干;張子龍;李深偉;李美
• 申請（專利權）人: 中華人民共和國上海出入境檢驗檢疫局
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所 31233
• 代理人: 黃志達

1.一種快速高通量的瘧原蟲檢測方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)血液樣本進行DNA液提?。?/p>

(2)PCR擴增：

a.PCR反應體系包括：PCR反應緩沖液,待測樣本基因特異性正、反向引物，PCR?Grade?H₂O,PCR?Control,DNA提取液；

b.將PCR反應液加入已含有待測基因特異性探針的芯片反應室內，將芯片放入機器進行擴增反應；特異性探針是根據特異性引物擴增區內設計，能夠區別其他物種；特異性探針點入芯片上；

(3)雜交：PCR擴增完后，將雜交反應液加入芯片，使雜交液和擴增液都進入到雜交艙內雜交反應；

(4)清洗：雜交后的芯片用洗液沖洗，直接用熒光掃描儀檢測；

(5)結果判讀；

所述的待測樣本基因為惡性瘧、間日瘧、三日瘧各自特有基因。

2.根據權利要求1所述的快速高通量的瘧原蟲檢測方法，其特征在于：所述的特有基因分別是惡性瘧的mdr、crt、18SrRNA基因，間日瘧的SSUrRNA、csp、18SrRNA基因，三日瘧的18SrRNA基因。

3.根據權利要求1所述的快速高通量的瘧原蟲檢測方法，其特征在于：所述的特異性正反引物和探針是：

惡性瘧原蟲

mdr基因

Pf1-F:GTGTTGAAAGATGGGTAAAGAGCAGA??(SEQ?ID?NO?1)

Pf1-R:CGTACCAATTCCTGAACTCACTTGTTC??(SEQ?ID?NO?2)

Probe:GAACAAAAAGAGTACCGCTGAA??(SEQ?ID?NO?3)

crt基因

Pf2-F:GGTGGAGGTTCTTGTCTTGGTAAATG??(SEQ?ID?NO?4)

Pf2-R:CGGATGTTACAAAACTATAGTTACC??(SEQ?ID?NO?5)

Probe：GTATTATTTATTTAAGTGTATGTGT??(SEQ?ID?NO?6)

18SrRNA基因

Lm2-F：ATTGCTTTTGAGAGGTTTTGTTAC??(SEQ?ID?NO?7)

Lm2-R：GCTGTAGTATTCAAACACAATGAAC??(SEQ?ID?NO?8)

Probe：CATAACAGACGGGTAGTCAT??(SEQ?ID?NO?9)

間日瘧原蟲

SSUrRNA基因

Pv1-F:AGTTCGTGAATATGATTTGTC??(SEQ?ID?NO?10)

Pv1-R:CTGCGCTTCTGTACTTGGC??(SEQ?ID?NO?11)

Probe:GGGGATTGCAATTATACTTCGTGTCG??(SEQ?ID?NO?12)

csp基因

Vp2-F:GGTGAGAACCCAGATGACGAGG??(SEQ?ID?NO?13)

Vp2-R:TGGACTCCATGCAGTGTAACCTGT??(SEQ?ID?NO?14)

Probe：GGTGATGGAGCAGCTGTACAG??(SEQ?ID?NO?15)

18SrRNA基因

Lm2-F：GCAACGCTTCTAGCTTAATCCAC??(SEQ?ID?NO?16)

Lm2-R：CAAGCCGAAGCAAAGAAAGTCC??(SEQ?ID?NO?17)

Probe：ACTTTGTGCGCATTTTGCTA??(SEQ?ID?NO?18)

三日瘧原蟲

18SrRNA基因

Pm1-F:GTTAAGGGAGTGAAGACGATCAGATACCGT??(SEQ?ID?NO?19)

Pm1-R:GCCCCAGAACCCAAAGACTTTGATTTCTCA??(SEQ?ID?NO?20)

Probe:ATGAGTGTTTCTTTTAGATAGC??(SEQ?ID?NO?21)

和

Pm2-F:ATAACATAGTTGTACGTTAAGAATAACCGC??(SEQ?ID?NO?22)

Pm2-R:AAAATTCCCATGCATAAAAAATTATACAAA??(SEQ?ID?NO?23)

Probe：GTATAATTTTTTATGCATGGGAAT??(SEQ?ID?NO?24)