[發明專利]檢測增強型綠色熒光蛋白基因的引物及其篩選方法與應用

在審

• 申請號: 201410696383.0
• 申請日: 2014-11-26
• 公開（公告）號: CN104404148A
• 公開（公告）日: 2015-03-11
• 發明（設計）人: 葛敏;張曉林;趙涵
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 馮子玲

1.一種檢測增強型綠色熒光蛋白基因的引物，其特征在于，所述引物為EGFP1或EGFP2；所述EGFP1的正向引物堿基序列如SEQ?ID?NO:1所示，EGFP1的反向引物堿基序列如SEQ?ID?NO:2所示；所述EGFP2的正向引物堿基序列如SEQ?ID?NO:3所示，EGFP2的反向引物堿基序列如SEQ?ID?NO:4所示。

2.一種篩選權利要求1所述引物的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟A：采用Primer3軟件設計檢測EGFP的強專化性引物，在基因上游設計12個引物，命名為gfpF_n(n＝1，…,12)；在基因下游設計13個引物，命名為gfpR_m(m＝1,…,13)；上下游引物分別兩兩組合，共組合156對引物；

步驟B：利用Karroten質粒提取試劑盒提取EGFP的表達質粒，利用植物基因組DNA提取試劑盒分別提取轉基因作物葉片DNA和非轉基因作物葉片DNA；

步驟C：引物篩選的方式分為3輪，每輪篩選設置重復實驗一次，第1輪篩選：利用無菌水作為模板進行PCR擴增，除去以無菌水為模板仍可擴增出條帶的引物；第2輪篩選：利用第1輪篩選出的引物，以EGFP的表達質粒DNA和無菌水為模板進行PCR擴增，選出能擴增出EGFP基因條帶并且在無菌水中擴增不出條帶的引物；第3輪篩選：利用第2輪篩選出的引物，以質粒DNA、轉基因和非轉基因作物DNA、無菌水4種為模板進行PCR擴增，選出能在質粒及轉基因作物中擴增出EGFP基因條帶、在非轉基因作物及無菌水中擴增不出條帶的引物。

3.按照權利要求2所述的方法，其特征在于，所述轉基因作物為轉基因玉米，非轉基因作物為非轉基因玉米。

4.按照權利要求2所述的方法，其特征在于，在所述步驟A中，檢測EGFP的強專化性引物的設計條件：Tm值為50℃～60℃，GC含量為50％～70％，引物長度為17bp～24bp。

5.按照權利要求2所述的方法，其特征在于，在所述步驟C中，PCR擴增反應體系：總反應體積為25.0μl，包括：1.0μl模板,2.5μl?10×PCRbuffer,1.0μl5μmol/L?Primer,2.0μl?2.5mmol/L?dNTPs,2.0μl?25mmol/L?MgCl₂,0.1μl?5U/μl?rTaq,16.4μl?ddH₂O。

6.按照權利要求2所述的方法，其特征在于，在所述步驟C中，PCR擴增條件：94℃反應3min；94℃反應40s,58℃反應40s,72℃反應45s,重復38個循環；72℃反應5min。

7.按照權利要求2所述的方法，其特征在于，在所述步驟C中，PCR擴增產物在質量體積分數2％的瓊脂糖凝膠上以80V電壓電泳45min。

8.按照權利要求1所述一種檢測增強型綠色熒光蛋白基因的引物的應用，其特征在于，以轉基因作物DNA為模板，利用EGFP1引物擴增EGFP基因，其擴增片段為445bp，或利用EGFP2引物擴增EGFP基因，其擴增片段為294bp，則待檢材料為EGFP轉基因陽性材料。