[發明專利]一種土壤中分離棉鈴疫病菌的方法

在審

• 申請號: 201410689794.7
• 申請日: 2014-11-27
• 公開（公告）號: CN105695333A
• 公開（公告）日: 2016-06-22
• 發明（設計）人: 趙鳴;王紅艷;隋潔;薛超;馬惠;鹿秀云;郭慶港
• 申請（專利權）人: 山東棉花研究中心
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12R1/645
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于農業領域，具體涉及一種土壤中分離棉鈴疫病菌的方法。

背景技術

爛鈴是棉花生產上的一大重要病害，近年來，棉花爛鈴病在黃河流域發生非常嚴重,棉花品質降低，產量下降，棉農經濟損失嚴重。棉鈴疫病是棉花鈴病的主要病害之一，開展棉鈴疫病研究能有效加強對棉花爛鈴的控制。目前開展棉鈴疫病研究時病菌采集主要有兩種途徑，一種是從發病棉鈴上分離獲得，此種方法因為已經有發病組織，所以較易獲得疫病致病菌，而且此種方法需要獲得發病棉鈴，全年只能在棉花結鈴初期進行采集；另一種方法是從土壤中分離獲得，此種方法不受采集時間限制，全年都可在棉田內采集土壤，然后進行致病菌分離。

土壤中病原真菌的分離。為了分離土壤中特定的病原真菌，需要用特殊的方法和選擇性培養基。疫霉屬真菌的分離從土壤中分離疫霉屬的真菌，可采用以下兩種方法：

1、利用植物的組織或器官作為餌料。棉鈴疫病菌的分離，可將棉鈴，放在保濕箱中，每個棉鈴用50g的土樣，覆蓋，在20～22⁰C下培養5～6d觀察孢子囊的產生。此種方法棉鈴可以在棉花鈴期從種植棉田采集獲得，但在其他時間12月-7月，需要在溫室中盆栽棉花，獲得棉鈴。

2、棉鈴疫病菌的土壤分離，也可以用選擇性培養基直接從土壤中分離。此種方法成本較高，需要使用特殊的選擇性培養基，成本和操作過程復雜。

發明內容

本發明針對不足，提出土壤中分離棉鈴疫病菌的方法，其特征在于：使用蘋果作為誘餌，分離土壤中的棉鈴疫病菌。

為實現上述發明的目的，本發明提供以下技術方案：一種土壤中分離棉鈴疫病菌的方法

1、市場購買的蘋果，用清水洗凈后擦干，用75%酒精進行表面消毒后待用。

2、將棉田采集的土壤放入大小適中的容器內（方盒或小盆），用噴霧器噴施純凈水進行土壤濕潤，濕度達到土壤手握成團，輕捏即散的狀態即可，不要過于潮濕。

3、表面消毒后的蘋果，在上半部和下半部分分別按照十字對稱的方位進行接菌針打孔，每個打孔點打孔一個，直徑在1mm以內，整個蘋果共打孔8個。

4、將蘋果埋入容器中的土壤內，25⁰C條件下培養，每日觀察蘋果的發病情況，待蘋果發病后將病健交界處蘋果組織接入到燕麥培養基平板上進行進一步培養，可獲得棉鈴疫病致病菌。

與現有技術相比，本發明施藥方法將蘋果用于替代棉鈴，進行棉鈴疫病的致病菌分離具有以下優點：

1、使用蘋果作為棉鈴的替代組織，蘋果更易獲得，全年均可購買，不受時間限制。

2、蘋果適合棉鈴疫病的致病菌的生長，對棉鈴疫病的致病菌獲率高。

3、蘋果果皮較厚，對蘋果保護作用好，土壤中誘捕發病時未打孔部位不易被病菌侵染，發病部位集中在打孔的周圍，便于后期操作。

4、蘋果體積較大，可設的打孔點8個，增加了棉鈴疫病的致病菌的侵染點，篩選效率提高。

5、簡化了棉鈴疫病的致病菌分離步驟，縮短了分離時間，提高了致病菌分離成功率和分離效率。

具體實施方式

實施例

（1）帶菌土壤采集：常規棉田，5點取樣，取表層3cm下土壤，每個取樣點取土500g，混合均勻待用，入土壤過于干燥需盆純凈水進行潤濕，濕度達到土壤手握成團，輕捏即散的狀態即可，不要過于潮濕。

（2）蘋果表面消毒：購買大小適中的蘋果，用清水洗凈后，用紗布或吸水紙擦干表面水分，用蘸有75%酒精的棉球，均勻擦拭蘋果表面，然后在蘋果上半部和下半部分分別按照十字對稱的方位進行接菌針打孔，每個打孔點打孔一個，直徑在1mm以內，整個蘋果共打孔8個。

（3）將2-3個打好空的蘋果埋入土壤中，每天觀察打孔處蘋果發病情況。

（4）待多個打孔點發病后，將蘋果取出，用清水沖洗后待用。

（5）分離用的培養基采用燕麥培養基：燕麥片30克、瓊膠17克、水1000毫升。燕麥片加水1000毫升,在沸水浴上加熱1小時,紗布過濾后加水補足1000毫升,加瓊膠熔化后分裝滅菌(121攝氏度,20分鐘)，自然冷卻至50攝氏度時倒入培養皿中，培養基凝固后備用。

（6）致病菌分離：將洗凈擦干的蘋果在超凈工作臺內再次進行表面消毒，使用75%酒精棉球擦拭表秒，用滅菌后的小手術刀片將蘋果病健交界部位的表皮劃開小口，挑出發病的蘋果組織，放入預先制備好的培養基平板中，培養皿用封口膜封閉后倒置于30⁰C培養箱內培養。