[發明專利]酸棗內生解淀粉芽孢桿菌新菌株SZ23及發酵液的制備方法和應用

在審

• 申請號: 201410683826.2
• 申請日: 2014-11-25
• 公開（公告）號: CN104498386A
• 公開（公告）日: 2015-04-08
• 發明（設計）人: 劉慧平;劉東;劉慧芹;張寶俊;韓巨才;張曉宇;任璐
• 申請（專利權）人: 山西農業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A01N63/02;A01P3/00;C12R1/07
• 代理公司: 太原華弈知識產權代理事務所14108
• 代理人: 李毅

1.一株解淀粉芽孢桿菌（Bacillus?amyloliquefaciens）新菌株SZ23，于2014年7月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC?No.9481。

2.根據權利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus?amyloliquefaciens）新菌株SZ23，其特征在于，解淀粉芽孢桿菌（Bacillus?amyloliquefaciens）新菌株SZ23是從山西省太谷地區的酸棗植株根組織為材料分離得到的內生細菌；將解淀粉芽孢桿菌新菌株SZ23在NA培養基上30℃恒溫培養，初期菌落呈乳白色、圓形、膿狀、邊緣整齊、菌落隆起，表面粘稠；隨著培養時間的延長，菌落變干，出現褶皺，顏色變為淺黃色，經掃描電鏡觀察，菌株SZ23菌體呈桿狀，周生鞭毛，大小(0.87～1.3)μm×（1.5～2.8）μm，該菌革蘭氏染色陽性，產芽孢，根據《常見細菌系統鑒定手冊》對菌株SZ23進行了生理生化鑒定，結果如下表所示：

菌株SZ23的生理生化特征

注：＋表示呈陽性反應；－表示呈陰性反應.

?提取新菌株SZ23的DNA，經PCR反應后得到一條約為1500bp左右的DNA片段，測序后獲得序列1451bp，將其上傳至GenBank獲取登錄號為KF483660，序列在NCBI網站Blast比對，發現與Bacillus?amyloliquefaciens（GU125620）和Bacillus?subtilis?(GQ199598)相似度都達到100%；構建Neighbor-Joining系統發育樹，結果顯示菌株SZ23與Bacillus?amyloliquefaciens和Bacillus?subtilis聚為一類，在系統發育上親緣關系較近；結合形態觀察及生理生化試驗，確定新菌株SZ23為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus?amyloliquefaciens）Bacillus?amyloliquefaciens。

3.根據權利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus?amyloliquefaciens）新菌株SZ23發酵液的制備方法如下：

(1)?種子液制備?從試管斜面上用接種針挑取菌株SZ23到斜面培養基上，恒溫25℃培養24h后接種到裝有100mL的?LB培養液的三角瓶中，180r/min振蕩培養12h，制得解淀粉芽孢桿菌新菌株SZ23的種子液；

(2)?發酵液制備?將解淀粉芽孢桿菌新菌株SZ23的種子液按照1%的比例接入由質量體積份的可溶性淀粉20份、酵母浸膏5份、蛋白胨10份、K₂HPO₄·3H₂O?2份、蒸餾水1000份制成的發酵培養基中，培養條件是：25－35℃、初始pH為9.0、搖床轉速180?－200r/min震蕩培養30h，制得解淀粉芽孢桿菌新菌株SZ23的發酵液。

4.用解淀粉芽孢桿菌（Bacillus?amyloliquefaciens）新菌株SZ23發酵液防治梨黑斑病的方法是：

在梨果采收前3?～5天用噴霧器在果實表面噴灑解淀粉芽孢桿菌新菌株SZ23的發酵液的50倍稀釋液，選擇天氣晴朗、日照充足的時間段實施防治；

或

將解淀粉芽孢桿菌新菌株SZ23發酵液用水稀釋50倍，梨果采摘后立即用該稀釋液浸泡2?min～3?min，置于塑料周轉箱，待果實自然晾干后再入保鮮庫預冷、貯藏，注意在自然晾干過程中，避免將梨果與土壤等其他可能攜帶病原菌的物質接觸。