[發明專利]一種銅綠假單孢菌的快速檢測試劑盒及其應用

無效

• 申請號: 201410682300.2
• 申請日: 2014-11-24
• 公開（公告）號: CN104388566A
• 公開（公告）日: 2015-03-04
• 發明（設計）人: 張輝;陳曦
• 申請（專利權）人: 武漢明曼基因工程有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種可視化銅綠假單孢菌環介導等溫擴增(LAMP)檢測試劑盒，其特征在于，由反應預混液、熒光顯色劑、內蓋附有滅菌濾紙片的檢測管組成，其中的反應預混液包括Bst?DNA聚合酶、反應緩沖液、dNTP、硫酸鎂、特異性引物組、甜菜堿和無菌雙蒸水；

所述特異性引物組包括外引物F3和B3，內引物FIP和BIP，其核苷酸序列如下：

F3：5’-TCTGCGTGCGATCACCA-3’

B3：5’-ACGACGCTCGCCCAGA-3’

FIP：5’-CGTGTACGTCCAGAGCGCGTTTTCTTCGAGTACGACAGCTCCG-3’

BIP：5’-CGAAAGACCTGAAAGGCAGCGGTTTTCCATATTGTACTCGCGGGTG-3’。

2.所述試劑盒的應用，其特征在于，通過對樣品簡單的處理便可快速檢測樣品中的銅綠假單孢菌；使用方法包括細菌DNA的提取、環介導等溫擴增和顯色結果判定：

1）、細菌DNA的提取：

采用DNA快速提取法，即將樣品稀釋液煮沸，上清液作為環介導等溫擴增反應的DNA模板；

2）、LAMP擴增：

采用25μl反應體系：內引物FIP和BIP各1.6μM，外引物F3和B3各0.2μM，dNTP?1mM，甜菜堿0.5M，硫酸鎂6mM，Bst?DNA聚合酶8U，模板DNA?5μl，10×ThermoPol?Reaction?Buffer?2.5μl，選擇64℃避光反應60分鐘；

3）、檢測結果判定：

將檢測管倒置甩動，使反應液與內蓋上的濾紙片充分混勻，室溫放置2分鐘；正置后用力甩動檢測管，使管內混有熒光顯色劑的反應液聚于檢測管底部，在比色卡背景下觀察反應液顏色：黃綠色則說明樣品中含有銅綠假單孢菌，棕色則說明樣品中沒有銅綠假單孢菌。