[發明專利]脅迫雨生紅球藻快速積累蝦青素的方法

有效

• 申請號: 201410680219.0
• 申請日: 2014-11-25
• 公開（公告）號: CN104480178B
• 公開（公告）日: 2019-05-03
• 發明（設計）人: 王培磊;孫業凱
• 申請（專利權）人: 臨沂大學
• 主分類號: C12P23/00
• 分類號: C12P23/00;C12R1/89
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種脅迫雨生紅球藻快速積累蝦青素的方法，其特征在于具體步驟如下：

步驟(1)培養液的準備

培養液成分：Ca(NO₃)₂0.4份，NaH₂PO₄0.1份，MgSO₄·7H₂O 0.05份，CuSO₄·5H₂O 0.02份，MnCl₂·4H₂O 0.1份，FeSO₄·7H₂O 0.04份，尿素0.5份，人尿1份，泛酸鈣0.03份，麥飯石粉0.04份，α-萘乙酸0.002份，肌醇0.001份，葉酸0.004份，尼古丁酸0.001份，維生素H 0.008份，EDTA 0.04份，土壤浸出液1.2份，冷開水1000份；裝入棕色磨口塞試劑瓶中，搖勻，密封，置入4℃冰箱保存備用；

步驟(2)三角燒瓶培養

取一3000毫升三角燒瓶，加入1500毫升步驟1所述培養液，選生長旺盛、無污染、處于指數生長期的雨生紅球藻藻種接種，接種要在上午9-10點進行，接種密度4萬個細胞/每毫升，輕輕搖勻，報紙和橡皮筋封口，放在微藻培養室中進行培養，空調控溫，日光燈管提供光照，不充氣，調節溫度至26℃，光照強度至5000lux，光暗周期＝12h/L+12h/D，即提供間歇光，12小時光照，12小時黑暗，每天手動搖瓶3次，每次45秒鐘，連續培養7天，轉入下一步驟；

步驟(3)白塑料桶培養

取一65升帶蓋的大口白塑料桶，市場有售，加入步驟1所述培養液40升，再加入步驟2連續培養7天的藻液1800毫升，輕輕搖動3分鐘，蓋上蓋子，進行培養；蓋子上打上2個孔，每個孔直徑10毫米，插入2根管子，一根為塑料管，長3米，直徑8毫米，一端連接空氣壓縮機，另一端插入到藻液底部，用以充氣，充入混合氣體，氣體成分＝空氣98％+純CO₂2％，連續不間斷充氣，氣量不宜太大，以讓藻細胞浮起不下沉即可；另一根較短，長30厘米，直徑10毫米，為比較硬的料管，用以排氣；將此塑料桶放入微藻培養室中培養，室內空調控溫，日光燈管照明，以打開燈管的數量多少來控制光照強度，提供連續不間斷光照，連續培養8天，前4天調節溫度至28℃，光照強度18000lux，因塑料桶壁的阻擋和吸收作用，到達藻液的實際光照強度為12000lux，后4天，調節溫度至30℃，光照強度20000lux，后轉入下一步驟；

步驟(4)藻細胞收集

取步驟3藻液1000份，加入0.5份甲殼素，充分攪拌15分鐘，再加入0.8份明礬，攪拌20分鐘，靜置、沉淀36小時，棄上清液，取底部紅色藻泥，藻細胞收集完畢；

步驟1中所述土壤浸出液制備方法：取樹林中松散、富含有機質的上層土壤1千克，加自來水5升，煮沸20分鐘，將泥漿倒入燒杯中，靜置24小時，后吸取上清液，倒入三角燒瓶中，加棉花塞，煮沸15分鐘，冷卻，靜置沉淀12小時，取上清液即得土壤浸出液，裝入磨口塞試劑瓶，密封，貼上標簽，置于4℃冰箱備用；

步驟1中所述人尿制備方法：取一3000毫升三角燒瓶，裝入人尿1500毫升，靜置，自然發酵48小時，放在電爐上加熱，煮沸3分鐘，冷卻，裝入磨口塞棕色試劑瓶，密封，置于4℃冰箱冷藏備用；

接種用的雨生紅球藻預先進行提純，以確保接種時藻種為純種且處于生長旺盛的指數生長期；

步驟1中各種營養鹽要按配方中提供的順序加入，以免發生化學反應；

步驟1中各種無機營養鹽和維生素預先配成母液且置于4℃冰箱冷藏保存備用，放置時間不要超過30天；

步驟1和2中所用三角燒瓶等玻璃儀器均需洗刷干凈放在85℃烘箱中烘干后使用；

步驟2所述接種過程需在上午9-10點且在無菌操作臺上進行；

步驟3中所用塑料桶要選用透光性好且韌性強度高，以提高光能利用率和塑料桶使用壽命；

步驟1中所用化學藥品純度均需化學純級別。