[發明專利]用于檢測施馬倫貝格病毒的套式RT-PCR引物組及試劑盒

有效

• 申請號: 201410670115.1
• 申請日: 2014-11-20
• 公開（公告）號: CN104388590A
• 公開（公告）日: 2015-03-04
• 發明（設計）人: 楊素;黃海超;陳軒;陶旻;徐海聶;許彩蕓;沙才華;廖秀云;羅寶正;薄清如
• 申請（專利權）人: 中華人民共和國珠海出入境檢驗檢疫局
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 鄭瑩

技術領域

本發明屬于分子生物學檢測領域，特別涉及一種用于檢測施馬倫貝格病毒的套式RT-PCR引物組及試劑盒。

背景技術

施馬倫貝格病(Schmallenberg，SB)是2011年11月在德國北萊茵-威斯特法倫州施馬倫貝格鎮牛羊中發現的一種新的病毒性動物傳染病，該病的主要臨床特征是：受感染母羊流產、死胎，新生羔羊畸形、成活率下降，感染牛表現為腹瀉、發熱、產奶量下降等，對畜牧業造成了較大危害。

目前SB的實驗室診斷方法主要包括細胞培養分離病毒等病原檢測方法，以及酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、間接免疫熒光試驗（IFA）和中和試驗（NT）等血清學方法。病毒分離通常是確診疫病的金標準，但由于成年患病動物常不表現臨床癥狀，難以掌握病毒血癥的具體時期，且費時費力，因此病毒分離的實施受到一定的限制，不適應快速檢測的需要。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于檢測施馬倫貝格病的套式RT-PCR引物組及試劑盒。

本發明的另一個目的在于提供上述RT-PCR引物組及試劑盒在檢測施馬倫貝格病上的應用。

本發明所采取的技術方案是：

一組用于檢測施馬倫貝格病的套式RT-PCR引物，?其是根據施馬倫貝格病毒核衣殼蛋白基因序列的高度保守區域設計的。其核苷酸序列如下所示：

外引物P1：5’-?TACATAAGACGGCACAAC?C?-3’（SEQ?ID?NO.1）；

外引物P2：5’-?GCATCAAGGAACATTTCG?-3’（SEQ?ID?NO.2）；

內引物P1：5’-TGGGCCGATGGTTATACAATG?-3’（SEQ?ID?NO.3）；

內引物P2：5’-?TTGGCGGAGGACTTTTTTCA-3’（SEQ?ID?NO.4）。

一種用于檢測施馬倫貝格病的套式RT-PCR試劑盒，其含有如上所述的引物組。

上述試劑盒中還含有RNA提取試劑、反轉錄試劑、施馬倫貝格病毒陽性對照和陰性對照。

所述的RNA提取試劑包括樣品裂解液、氯仿、DEPC-乙醇、異丙醇和DEPC-H₂O中的一種或多種；所述的反轉錄試劑包括反轉錄緩沖液、MgCl₂、dNTP、RNA酶抑制劑、隨機引物、AMV、反轉錄酶和DEPC-H₂O中的一種或多種；所述的施馬倫貝格病毒陽性對照為施馬倫貝格病毒陽性樣板的cDNA，所述陰性對照為所述陰性對照為無菌采取澳洲進口牛血清，經檢測BSV、BTV、EHDV、AKV、BVDV、IBRV為陰性。

以上所述的試劑盒在施馬倫貝格病檢測中的應用。

本發明的有益效果是：本發明建立的套式RT-PCR試劑盒具有特異、敏感、重復性好、快速、費用低廉等優點，可大范圍用于施馬倫貝格病的快速初篩。

附圖說明

圖1為一步式??RT-PCR電泳結果圖（M：DNA?Marker?DL-2000；1：pMD-SBV質粒；N：陰性對照；B：空白對照）；

圖2?為套式PCR檢測結果圖（M：DNA?Marker?DL-2000；P：陽性對照；1：被檢樣品；N：陰性對照；B：空白）；

圖3為外引物特異性試驗電泳圖（M：DNA?Marker?DL-2000；P：陽性對照?N：陰性對照；1：BTV；2：EHDV；3：AKV；4：BVDV；5：IBRV；6：SBV；?B：空白對照）；

圖4為內引物特異性試驗電泳圖（M：DNA?Marker?DL-2000；P：陽性對照?N：陰性對照；1：BTV；2：EHDV；3：AKV；4：BVDV；5：IBRV；6：SBV；?B：空白對照）；

圖5為外引物敏感性試驗電泳圖（M：DNA?Marker?DL-2000；P：陽性對照；N：陰性對照；B：空白對照；1：10^-1稀釋；2：10^-2稀釋；3：10^-3稀釋；4：10^-4稀釋；5：10^-5稀釋；6：10^-6稀釋7：10^-7稀釋；8：10^-8稀釋；9：10^-9稀釋）；