[發(fā)明專利]一種植物種子中調(diào)節(jié)基因表達(dá)的啟動(dòng)子與內(nèi)含子及應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410669174.7
• 申請(qǐng)日: 2014-11-12
• 公開（公告）號(hào): CN104711261A
• 公開（公告）日: 2015-06-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉峰;孫杰;汪小東;趙伊英
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 石河子大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域；本發(fā)明涉及植物中基因時(shí)空表達(dá)的調(diào)節(jié)。本發(fā)明描述了來自棉花的核苷酸序列，這些核苷酸序列主要包括兩個(gè)調(diào)節(jié)元件：啟動(dòng)子和內(nèi)含子；利用這些序列來構(gòu)建植物表達(dá)載體，遺傳轉(zhuǎn)化植株，調(diào)控目標(biāo)基因在植物種子中的時(shí)空表達(dá)。

背景技術(shù)

啟動(dòng)子是基因表達(dá)所必需的，其決定了外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的空間、時(shí)間和表達(dá)的強(qiáng)度等，是人們定向改造生物的重要限制因素。植物基因啟動(dòng)子按其作用方式大體可以分為三類，即組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和組織特異性啟動(dòng)子。

目前在植物表達(dá)載體中廣泛應(yīng)用的啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子。然而，由于組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)外源基因在受體植物內(nèi)所有部位持續(xù)的表達(dá)，不僅造成浪費(fèi)，而且往往會(huì)影響植株正常的生長發(fā)育。

組織特異型啟動(dòng)子可將外源基因集中在某一時(shí)間和/或目標(biāo)組織中表達(dá)，在這類啟動(dòng)子調(diào)控下，基因往往只在某些特定的器官或組織部位表達(dá)，并表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性。例如煙草的花粉絨氈層細(xì)胞中特異表達(dá)基因啟動(dòng)子TA29，豌豆的豆清蛋白基因啟動(dòng)子可在轉(zhuǎn)化植物種子中特異性表達(dá)，馬鈴薯塊莖儲(chǔ)藏蛋白基因啟動(dòng)子在塊莖中優(yōu)勢表達(dá)；水稻胚乳特異性啟動(dòng)子控制外源基因在水稻胚乳中高效表達(dá)等。其不僅避免因在轉(zhuǎn)基因植株非目標(biāo)組織中表達(dá)所造成的能量浪費(fèi)，而且可避免因在非收獲器官或組織中表達(dá)目標(biāo)蛋白而造成的轉(zhuǎn)基因食品的潛在的安全性等問題。因此，組織特異性啟動(dòng)子不僅有助于闡明植物形態(tài)、發(fā)育、代謝途徑等基礎(chǔ)理論，而且具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

種子特異型啟動(dòng)子是組織特異型啟動(dòng)子的一種，它可以控制外源基因在植物種子中高效表達(dá)，避免外源基因在植物的其他部位表達(dá)，從而減少對(duì)植物的不利影響。

在基因工程研究中，啟動(dòng)子過強(qiáng)或過弱都有可能影響到基因的表達(dá)并對(duì)其它基因的表達(dá)產(chǎn)生影響。挑選一個(gè)組織特異性強(qiáng)、表達(dá)模式與強(qiáng)度適當(dāng)?shù)膯?dòng)子往往是基因工程實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。

目前，在棉花的遺傳轉(zhuǎn)化以及基因功能等研究方面，可利用的種子特異表達(dá)啟動(dòng)子仍較少，開發(fā)新型種子特異表達(dá)啟動(dòng)子和深入了解這些啟動(dòng)子在結(jié)構(gòu)與功能上的區(qū)別將有助于在基因工程中對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行精細(xì)調(diào)控。

此外，在許多植物中都已證實(shí)內(nèi)含子的存在，尤其是當(dāng)內(nèi)含子位于轉(zhuǎn)錄本5′UTR時(shí)，可以顯著增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄效率。在單子葉植物中能夠提高基因表達(dá)量的內(nèi)含子有來自玉米的Adhl、Shl、Bzl、Hsp82、Actin、Ubil和GapAl基因等和來自水稻的SalT、Actl、OsTubAl和OsCDPK2基因等；在雙子葉植物中可以提高表達(dá)量的內(nèi)含子有來自矮牽牛的RbcS基因和馬鈴薯的ST-LS1基因等。內(nèi)含子介導(dǎo)的增強(qiáng)效應(yīng)可以提高基因表達(dá)100倍以上，一般在2-10倍左右。內(nèi)含子對(duì)基因表達(dá)的增強(qiáng)程度與許多因素有關(guān)，如內(nèi)含子自身特征、啟動(dòng)子和外顯子序列特征、細(xì)胞類型等。不同內(nèi)含子對(duì)同一基因表達(dá)增強(qiáng)的程度不同，玉米Shl基因的內(nèi)含子1可以使報(bào)告基因表達(dá)水平增強(qiáng)40倍，而玉米Adhl基因的內(nèi)含子1使報(bào)告基因的表達(dá)水平僅提高4倍。Adhl基因的內(nèi)含子2和6均能不同程度地增強(qiáng)報(bào)告基因的表達(dá)水平，但內(nèi)含子9卻不能。并且不同內(nèi)含子對(duì)同一基因的表達(dá)活性的影響效果也不相同。

已有的研究表明，包括陸地棉(G.hirsutum)、海島棉(G.barbadense)、雷蒙德氏棉(G.raimondii)以及魯賓遜氏棉(G.robinsonii)等棉屬的FAD2-1基因都含有一個(gè)位于5′UTR的內(nèi)含子。FAD2-1的內(nèi)含子位于翻譯起始位點(diǎn)上游-9bp處；在棉花中，F(xiàn)AD2-1的5′UTR內(nèi)含子富含AT，并具有典型的自主復(fù)制元件(ARS)等，該內(nèi)含子對(duì)所調(diào)控基因的時(shí)空表達(dá)作用仍有待進(jìn)一步的研究。

因此，在本領(lǐng)域內(nèi)存在用于分離并鑒定新的種子特異或優(yōu)勢表達(dá)啟動(dòng)子及表達(dá)調(diào)控元件的需要，以便獲得具有不同廣度、表達(dá)水平和細(xì)胞類型表達(dá)特異性的啟動(dòng)子等表達(dá)調(diào)控元件用于種子特異性與種子偏好性表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容

在本發(fā)明中，提供了用于在轉(zhuǎn)基因植物中啟動(dòng)目標(biāo)基因在植物種子中優(yōu)勢表達(dá)的啟動(dòng)子。在SEQ?ID?NO.1中給出該啟動(dòng)子的核苷酸序列。

在本發(fā)明中，提供了用于在轉(zhuǎn)基因植物中增強(qiáng)目標(biāo)基因在種子中優(yōu)勢表達(dá)的表達(dá)元件——棉花FAD2-1的5′UTR內(nèi)含子。在SEQ?ID?NO.2中給出該內(nèi)含子的核苷酸序列。