[發(fā)明專利]一種高拷貝pTerm質(zhì)粒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410669115.X
• 申請日: 2014-11-20
• 公開（公告）號: CN104388454B
• 公開（公告）日: 2018-03-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 薛高旭;馮愛華;孫中平;廖國娟
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州金唯智生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/65
• 代理公司: 北京三聚陽光知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11250
• 代理人: 張建綱

1.一種高拷貝pTerm質(zhì)粒，其特征在于，由colE1復(fù)制子基因、原核生物轉(zhuǎn)錄終止子、多克隆位點以及抗生素抗性基因組成；在多克隆位點的兩端分別設(shè)置至少一個所述原核生物轉(zhuǎn)錄終止子；所述原核生物轉(zhuǎn)錄終止子為不依賴ρ因子的原核生物轉(zhuǎn)錄終止子；所述抗生素抗性基因為bla基因或Kan基因中的任一種。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高拷貝pTerm質(zhì)粒，其特征在于，所述bla基因如SEQ ID No.1所示的序列結(jié)構(gòu)，所述Kan基因如SEQ ID No.4所示的序列結(jié)構(gòu)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的高拷貝pTerm質(zhì)粒，其特征在于，所述質(zhì)粒的拷貝數(shù)為380-560個。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的高拷貝pTerm質(zhì)粒，其特征在于：

所述質(zhì)粒記為pTerm-HA，如SEQ ID No.7所示的序列結(jié)構(gòu)；所述質(zhì)粒中，自5’端第22bp～615bp為Terminator基因； 961bp～1821bp為bla基因；1916bp～2598bp為colE1復(fù)制子基因；其中多克隆位點在329bp～370bp處；或者，

所述質(zhì)粒記為pTerm-HK，如SEQ ID No. 8所示的序列結(jié)構(gòu)；所述質(zhì)粒中，自5’端第132bp～725bp為Terminator基因；1071bp～1886bp為Kan基因；1981bp～2663bp為colE1復(fù)制子基因；其中多克隆位點在439bp～480bp處。

5.一種構(gòu)建權(quán)利要求1-4任一所述的高拷貝pTerm質(zhì)粒的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一：人工設(shè)計并合成所述的colE1復(fù)制子基因、含有原核生物轉(zhuǎn)錄終止子基因和多克隆位點的基因片段、抗生素抗性基因片段；所述含有原核生物轉(zhuǎn)錄終止子和多克隆位點的基因片段中在所述多克隆位點的兩端分別設(shè)置至少一個所述原核生物轉(zhuǎn)錄終止子；

步驟二：運(yùn)用多段重組法將所述colE1復(fù)制子基因片段、抗生素抗性基因片段和含有原核生物轉(zhuǎn)錄終止子和多克隆位點的基因片段連接環(huán)化，最終得到環(huán)形的質(zhì)粒。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的高拷貝pTerm質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的多段重組法為Gibson重組方法，反應(yīng)體系及條件：按1:1:1的摩爾比取所述colE1基因片段、抗生素抗性基因片段和含有原核生物轉(zhuǎn)錄終止子和多克隆位點的基因片段，加入滅菌去離子水，再加入Gibson Assembly Master Mix試劑， 50℃下反應(yīng)至得到環(huán)形質(zhì)粒。

7.一種構(gòu)建權(quán)利要求1-4任一所述的高拷貝pTerm系列質(zhì)粒的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一：人工合成所述抗生素抗性bla基因或Kan基因片段；

步驟二：按照權(quán)利要求5或6所述方法構(gòu)建得到含所述抗生素抗性bla基因或Kan基因的pTerm質(zhì)粒，分別以所述含抗生素抗性bla基因或Kan基因的質(zhì)粒為模板，F(xiàn)-pTerm-HA/HK、R-pTerm-HA/HK為引物,通過PCR擴(kuò)增得到colE1-含有原核生物轉(zhuǎn)錄終止子和多克隆位點的基因片段，所述含有原核生物轉(zhuǎn)錄終止子和多克隆位點的基因片段中在所述多克隆位點的兩端分別設(shè)置至少一個所述原核生物轉(zhuǎn)錄終止子；所述引物包括： F-pTerm-HA/HK：5’-ctgtcagaccaagtttactcatatatactt -3’；R-pTerm-HA/HK：5’-TTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATA -3’；步驟三：運(yùn)用Gibson重組方法，將構(gòu)建的所述colE1-原核生物轉(zhuǎn)錄終止子基因片段分別與所述抗生素抗性Kan基因或bla基因片段進(jìn)行組裝。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的高拷貝pTerm質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的Gibson重組方法反應(yīng)體系及條件：按1:1的摩爾比取所述colE1-含有原核生物轉(zhuǎn)錄終止子和多克隆位點的基因片段分別與所述抗生素抗性bla基因或Kan基因片段，加入滅菌去離子水，再加入Gibson Assembly Master Mix試劑，50℃下反應(yīng)至得到環(huán)形質(zhì)粒。

9.權(quán)利要求1-4任一所述的高拷貝pTerm質(zhì)粒在基因克隆、篩選和測序領(lǐng)域中的應(yīng)用。