[發(fā)明專利]人類骨髓細(xì)胞處理試劑盒及細(xì)胞處理方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410659490.6
• 申請日: 2014-11-19
• 公開（公告）號: CN105670991A
• 公開（公告）日: 2016-06-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊淑芬
• 申請（專利權(quán)）人: 楊淑芬
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 鞍山貝爾專利代理有限公司 21223
• 代理人: 孔金滿

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)，特別是一種人類骨髓細(xì)胞處理試劑盒及細(xì)胞處理方法。

背景技術(shù)

隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，用于人類血液細(xì)胞的分離技術(shù)也得到了長足的發(fā)展，目前主要有以下幾種處理方法：免疫磁珠法、流式細(xì)胞儀法、血細(xì)胞分離機(jī)法和培養(yǎng)擴(kuò)增法，上述方法存在造價高，中低收入患者不適用，對細(xì)胞本身活性有損傷，影響細(xì)胞治療療效，患者承擔(dān)一定的生命危險，污染率高，干細(xì)胞向未知方向分化為未知干細(xì)胞，時間長等缺陷。

CN1948467A公開了一種用于分離骨髓單個核細(xì)胞的試劑盒，其缺點是由于使用該專利直接分離血液中的干細(xì)胞，數(shù)量不足以臨床治療使用，所以該專利進(jìn)行了細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)的細(xì)胞污染率高，體外模擬體內(nèi)環(huán)境使細(xì)胞擴(kuò)增，導(dǎo)致培養(yǎng)出的細(xì)胞有形態(tài)沒功能，不能用于臨床治療；CN101144070A公開了一種骨髓臍帶血干細(xì)胞體外分離試劑盒及其應(yīng)用方法，其缺點是該專利試劑中添加了lin抗體，導(dǎo)致成本大大提高，投入到臨床使用中后，給中低收入患者造成負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致患者看不起病，接受不起細(xì)胞治療，并且使用了lin抗體對細(xì)胞清洗造成了較大負(fù)擔(dān)，此種物質(zhì)進(jìn)入人體后會發(fā)生何種變化還是未知數(shù)，還有待進(jìn)一步研究。

綜上，現(xiàn)有細(xì)胞分離技術(shù)主要存在以下幾方面問題：1、治療成本高。完成細(xì)胞分離工作的儀器設(shè)備（如：血細(xì)胞分離機(jī)及流式細(xì)胞儀）價格昂貴，導(dǎo)致治療成本升高，增加了患者的治療費用，不利于項目的推廣和普及；2、細(xì)胞活性低。免疫磁珠法和流式細(xì)胞儀法篩選出來的均是被標(biāo)記了的細(xì)胞，這些分選方法均存在篩選細(xì)胞范圍小、細(xì)胞負(fù)重后活性降低以及標(biāo)記物留在人體內(nèi)會變成什么還是未知等問題；3、細(xì)胞液體積大。使用血細(xì)胞分離機(jī)分離的一般為外周血，且需要采集前打2-7天動員劑，將骨髓中干細(xì)胞動員到外周血里，經(jīng)血細(xì)胞分離機(jī)處理后篩選出的細(xì)胞液體積較大，一般都超過50ml，且紅細(xì)胞去除不干凈。最后得到的細(xì)胞懸液體積大、質(zhì)量不佳，只能用于自體皮下注射；4、獲取細(xì)胞時間過長。培養(yǎng)擴(kuò)增一周后才能用于臨床治療，時間過長會延誤治療的最佳時機(jī)，影響治療效果，培養(yǎng)期間造成污染率提高；5、傳統(tǒng)的分離方法僅限于實驗室及科研使用。許多分離方法操作過程繁瑣，對人員的專業(yè)要求較高，既費時又費力。從實驗方法到臨床應(yīng)用還需要技術(shù)改進(jìn)；6、不能產(chǎn)業(yè)化。實驗成本高、操作環(huán)節(jié)中污染機(jī)率大、細(xì)胞液的保存運(yùn)輸條件不備，導(dǎo)致提取的細(xì)胞液數(shù)量有限，滿足不了臨床治療的大量需求；另外，上述相關(guān)專利還存在原料來源復(fù)雜、配制繁瑣、對于分離哪種血液針對性不強(qiáng)（因為人類血和動物血細(xì)胞存在一定差異），原料用到質(zhì)量難以控制的生物制品等缺點。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了提供一種可操作性強(qiáng)、臨床安全性高、便于臨床推廣的人類骨髓細(xì)胞處理試劑盒及細(xì)胞處理方法，該試劑盒易于存儲運(yùn)輸、可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)、使用方便快捷。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：

一種人類骨髓細(xì)胞處理試劑盒，其特征在于，含有以下三種試劑：

1號試劑為稀釋劑：0.5%-20%氯化鈉注射液或PBS液，

2號試劑為沉淀劑：0.5%-20%羥乙基淀粉或甲基纖維素，

3號試劑為分層液：由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度為1.0-1.2的分層液。

一種人類骨髓細(xì)胞處理方法，其特征在于：將含有枸櫞酸鈉抗凝液的骨髓加入到含有20-350毫升1號試劑的大容量培養(yǎng)液瓶中，再加入4-200毫升2號試劑搖勻，后靜置待分層后吸取上層細(xì)胞液以500-4000rpm離心1-20分鐘，離心濃縮后用生理鹽水稀釋到10-150毫升鋪到1-100毫升3號液上層，然后以500-4000rpm離心1-60分鐘使分出干細(xì)胞層，收集干細(xì)胞層后用生理鹽水清洗細(xì)胞備用。

本發(fā)明的有益效果是：

1、將試劑盒中1號2號3號試劑組合應(yīng)用，利用人類各種血細(xì)胞密度不同，通過2號試劑結(jié)合血液中紅細(xì)胞等不能起到臨床治療效果的細(xì)胞，使其重量增加，沉淀到細(xì)胞培養(yǎng)液瓶的底部，再利用各種細(xì)胞密度差異將它們分散于自上而下的試劑層次中去除人類骨髓中的紅細(xì)胞，血漿，血小板，血紅蛋白，粒細(xì)胞等，經(jīng)過本發(fā)明分離的干細(xì)胞回收率能夠達(dá)到90%以上，由于干細(xì)胞等細(xì)胞沒有標(biāo)記物等負(fù)重，使細(xì)胞存活率檢測大于98%。

2、1-3號試劑原料便宜，配置過程簡單質(zhì)量可控，具有造價低，無任何標(biāo)記物，保留原有細(xì)胞活性，細(xì)胞液體積小，干細(xì)胞種類齊全，分離操作時間短1小時左右即可完成，細(xì)胞數(shù)量能夠滿足臨床治療的需要等優(yōu)點。