[發明專利]一種可用于藍白篩選的多功能的TA克隆載體系統及其用途

在審

• 申請號: 201410659108.1
• 申請日: 2014-11-18
• 公開（公告）號: CN104357472A
• 公開（公告）日: 2015-02-18
• 發明（設計）人: 李凱;潘韻芝
• 申請（專利權）人: 蘇州大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66;C12Q1/68
• 代理公司: 蘇州創元專利商標事務所有限公司 32103
• 代理人: 范晴

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，涉及醫學診斷和生物技術。通過調整編碼框架的方法，構建三種TA克隆載體。與常規商品化TA載體相比，除保留了由藍變白的篩選之外，增加了由白變藍的新選擇，可用于微小突變的檢測和反因子核酸酶活性的檢測。

背景技術

目前，分子生物學實驗中大多數克隆載體都是經人工構建的，基本上都帶有可供選擇的遺傳標志或表型特征。藍白斑篩選(β-半乳糖苷酶系統)是較常用的篩選標記。

此類載體攜帶lacZ’基因，它編碼β-半乳糖苷酶的N-末端(α-肽)，并且處于誘導物IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，與乳糖結構類似但不能被β-半乳糖苷酶降解)誘導的啟動子調控之下。質粒轉化的宿主菌為LacZ△M15基因型(含有編碼N-末端缺陷型的β-半乳糖苷酶多肽的基因)。未重組的質粒轉化宿主菌后，在IPTG的誘導下，質粒與宿主菌分別表達缺陷但可以相互補償的兩個肽(即α-互補)，形成了有功能的β-半乳糖苷酶，該酶能把培養基中無色的X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)底物分解成半乳糖和深藍色的5-溴-4-氯-靛藍，菌落呈現藍色。但當外源DNA插入質粒位于α-肽編碼序列中的多克隆位點時，由于破壞了α-肽的閱讀框架，使其編碼的α-肽失去活性，則重組子所在的細菌不能完成α互補，不能形成有活性的β-半乳糖苷酶，致使重組菌形成白色菌落。因此，可以借助藍白斑篩選出重組子.

盡管藍白斑篩選應用了三十余年，但假陽性和假陰性率仍然很高。Slilaty?SN和Lebel?S.[1]研究證明，藍白斑篩選的載體，通常將插入位點放在LacZ基因的起始密碼子ATG到第7個氨基酸密碼子之間。但如果將插入位置改變到LacZ基因的第11-36個氨基酸密碼子之間，那么就可以完全消除假陽性和假陰性。Genomics?One公司正是利用了他們的研究結果開發出TrueBlue技術，同樣是藍白斑篩選，但準確率可達100％。不過實際操作中仍出現一定程度的假陽性和假陰性。

為了解決現有技術中存在的上述缺陷，本發明由此而來。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種高效率和多功能的TA克隆載體體系。該載體體系的優點是既能采用由藍變白的選擇方式，又能采用由白變藍的選擇方式，降低了假陽性和假陰性的發生，除能用于克隆PCR產物外，還能用于微小病變的檢測，能用于反因子核酸酶活性的檢測等。

為解決上述技術問題，本發明的技術方案為，一種可用于藍白篩選的多功能的TA克隆載體系統，其由pMD19-JZ3，pMD19-JZ2,和pMD19-JZ1三種質粒組成；其中，pMD19-JZ3的基因序列為Seq?No.3，pMD19-JZ2的基因序列為Seq?No.2，其中堿基N選自A,T,C,G；pMD19-JZ1的基因序列為Seq?No.1,其中堿基N選自A,T,C,G。

本發明的優選技術方案中，質粒體pMD?19-JZ3為本身閱讀框未發生移碼的載體；質粒體pMD?19-JZ2為本身閱讀框因增加了二對堿基發生移碼的載體；質粒體pMD?19-JZ?1為本身閱讀框因增加了一對堿基發生移碼的載體。

本發明的優選技術方案中，pMD19-JZ2的基因序列為Seq?No.2，第433位堿基N為g,第434位堿基N為t；pMD19-JZ1的基因序列為Seq?No.1,第433位堿基N為t。

本發明的第二方面的所要解決的技術問題是提供一種多功能的TA克隆載體體系用于亞克隆，其中，TA克隆載體體系由pMD19-JZ3，pMD19-JZ2,和pMD19-JZ1三個質粒體組成；其中，pMD19-JZ3的基因序列為Seq?No.3，pMD19-JZ2的基因序列為Seq?No.2，pMD19-JZ1的基因序列為Seq?No.1。

本發明的第三方面的所要解決的技術問題是提供一種多功能的TA克隆載體體系用于用于微小病變的基因檢測，其中，TA克隆載體體系由pMD19-JZ3，pMD19-JZ2,和pMD19-JZ1三個質粒體組成；其中，pMD19-JZ3的基因序列為Seq?No.3，pMD19-JZ2的基因序列為Seq?No.2，pMD19-JZ1的基因序列為Seq?No.1。