[發(fā)明專利]一種惡臭假單胞菌檢測試紙條及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410657289.4
• 申請日: 2014-11-14
• 公開（公告）號: CN104374914B
• 公開（公告）日: 2017-06-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 章禮平;李登峰;方靜;劉聯(lián)國;劉飛;陳梅娟
• 申請（專利權(quán)）人: 寧波大學(xué)
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/531
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種惡臭假單胞菌檢測試紙條的制備方法，其特征在于：所述的試紙條由PVC底板和在PVC底板上依次搭接的樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜及吸水墊；所述的結(jié)合墊上包被有抗惡臭假單胞菌卵黃抗體-膠體金標(biāo)記物，所述的硝酸纖維素膜上分別設(shè)置有由惡臭假單胞菌超聲波破碎液包被的檢測線和由兔抗雞卵黃抗體包被的質(zhì)控線；所述的惡臭假單胞菌超聲波破碎液的包被量為1-2μL/cm；所述的兔抗雞卵黃抗體的包被量為1-2μL/cm；所述的惡臭假單胞菌超聲波破碎液是將惡臭假單胞菌抗原用PBS重懸，經(jīng)超聲波破碎后4000rpm離心5min所得的上清液；所述的試紙條的制備方法包括以下步驟：

(1)樣品墊的制備

將玻璃纖維紙浸泡于含1wt％牛血清白蛋白、2.5wt％蔗糖、1wt％海藻糖、1wt％吐溫-20的pH 7.2的0.01M PBS緩沖液中30min后取出，于37℃干燥2-3h即得到樣品墊，真空封裝，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

(2)特定包被的結(jié)合墊的制備

將玻璃纖維紙浸泡于含1wt％牛血清白蛋白、2.5wt％蔗糖、1wt％海藻糖，1wt％吐溫-20的pH7.2的0.01M PBS緩沖液中30min后，于37℃干燥1-2h后，在每平方厘米的玻璃纖維紙上均勻噴涂10-20μL的抗惡臭假單胞菌卵黃抗體-膠體金標(biāo)記物，真空冷凍干燥1-2h，即得到結(jié)合墊，真空封裝，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

(3)特定包被的硝酸纖維素膜的制備

將惡臭假單胞菌超聲波破碎液用點膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上形成檢測線，將兔抗雞卵黃抗體用點膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上形成質(zhì)控線，即得到特定包被的硝酸纖維素膜，真空冷凍干燥1-1.5h，真空封裝，4℃保存?zhèn)溆茫黄渲袡z測線與質(zhì)控線相互平行，所述的檢測線靠近結(jié)合墊端，所述的質(zhì)控線靠近吸水墊端；

(4)試紙條的制備

將步驟(1)得到的樣品墊、步驟(2)得到的特定包被的結(jié)合墊、步驟(3)得到的特定包被的硝酸纖維素膜和吸水墊按序搭接并粘貼于底板上，裁成4-6mm寬的細(xì)條，即得惡臭假單胞菌檢測試紙條，真空封裝，4℃保存；

所述的結(jié)合墊上包被的抗惡臭假單胞菌卵黃抗體-膠體金標(biāo)記物的制備方法具體操作如下：

將抗惡臭假單胞菌卵黃抗體與膠體金顆粒直徑為25-50nm的膠體金溶液按6-8μg：1mL混合后，在pH 5.4的條件下通過攪拌振蕩30-60min，加含10wt％的牛血清白蛋白的PBST緩沖液作為穩(wěn)定劑，采用低速離心2000-3500rpm，10-20min，再高速離心12000-15000rpm，1-1.5h，取離心管底部暗紅色沉淀即得到抗惡臭假單胞菌卵黃抗體-膠體金標(biāo)記物，用含1wt％牛血清白蛋白、2.5wt％蔗糖、1wt％海藻糖，0.02wt％疊氮化鈉的pH 7.2的0.01M PBS緩沖液重懸至所述膠體金溶液體積的1/10-1/20作為其工作濃度。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種惡臭假單胞菌檢測試紙條的制備方法，其特征在于所述的惡臭假單胞菌抗原的制備方法如下：取實驗室-80℃保存的惡臭假單胞菌種，在LB固體培養(yǎng)基中劃線活化，28℃倒置培養(yǎng)24h后挑取單菌落接種于含5mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，28℃，200rpm培養(yǎng)12-18h，將培養(yǎng)的菌液用LB液體培養(yǎng)基按1∶100稀釋到三角燒瓶中，28℃，200rpm擴大培養(yǎng)，每隔一段時間測其OD600值，當(dāng)其OD600值達(dá)到0.4-0.6時停止培養(yǎng)，將培養(yǎng)的菌液在4℃進行5000rpm離心10min，棄上清，下層沉淀用pH 7.2的0.01M PBS重懸洗滌，再次5000rpm離心10min，沉淀再次用PBS重復(fù)上述洗滌2次，最終得到的沉淀即為惡臭假單胞菌抗原。