[發明專利]奶牛早期妊娠的熒光定量PCR檢測試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 201410657206.1
• 申請日: 2014-11-18
• 公開（公告）號: CN104328202A
• 公開（公告）日: 2015-02-04
• 發明（設計）人: 程蕾;向敏;王定發;劉曉華;胡修忠;夏瑜;凌明湖
• 申請（專利權）人: 武漢市畜牧獸醫科學研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 武漢智權專利代理事務所(特殊普通合伙) 42225
• 代理人: 張凱;劉麗君

1.一種基于熒光定量PCR技術的奶牛早期妊娠檢測試劑盒，包含牛ISG15基因和內參基因β-Actin特異性引物對，其中，所述的牛ISG15基因的引物對是：SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2，β-Actin的引物對是：SEQ?ID?NO：3和SEQ?ID?NO：4，其特征在于還包含牛RSAD2基因特異性引物對，所用引物序列如SEQ?ID?NO：5和SEQ?ID?NO：6所示。

2.如權利要求1所述試劑盒，其特征在于所述試劑盒的統一濃度和1人份測試用量統一標準為：

ISG15-F?10μmol/L?0.5μL

ISG15-R?10μmol/L?0.5μL

RSAD2-F?10μmol/L?0.5μL

RSAD2-R?10μmol/L?0.5μL

β-Actin-F?10μmol/L?0.5μL

β-Actin-R?10μmol/L?0.5μL。

3.一種基于熒光定量PCR技術的奶牛早期妊娠檢測方法，包括如下步驟：

(1)血液標本的收集

采集奶牛發情后人工授精前0d和人工授精后18d的外周血1.5-2ml，抗凝，低溫冷藏；

(2)標本RNA的提取

標本采集后2h內用血液總RNA提取試劑盒完成標本中總RNA提取，之后利用NanoDrop?2000超微量分光光度計分析RNA樣本濃度與純度，OD_260/280＝1.9-2.1，同時采用1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，通過質檢的樣本分裝后，于-80℃保存備用；

(3)逆轉錄反應

逆轉錄采用試劑盒進行，每個反應RNA用量為500ng，根據RNA的濃度計算得出每次反應所需的體積，按照試劑盒說明書進行；

(4)熒光定量PCR檢測ISG15和RSAD2基因在奶牛外周血中的相對表達量

1)目的基因和內參基因引物的設計與合成

牛ISG15基因的引物對信息如SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2所示的序列；內參基因β-Actin的引物對信息如SEQ?ID?NO：3和SEQ?ID?NO：4所示的序列；牛RSAD2基因引物對序列如SEQ?ID?NO：5和SEQ?ID?NO：6；

2)熒光定量PCR反應體系

牛ISG15、RSAD2基因和內參基因β-Actin熒光定量PCR擴增體系均為：Green?10μl，上下游引物各0.5μl(10μmol/L)，cDNA模板0.3μl，ddH₂O?8.7μl，體系共20μl；

3)熒光定量PCR反應條件

ISG15基因反應條件：95℃預變性60s，95℃變性15s，62℃退火15s；72℃延伸30s，共40個循環；

RSAD2基因反應條件：95℃預變性60s，95℃變性15s，58℃退火15s；72℃延伸30s，共40個循環；

β-Actin基因反應條件：95℃預變性60s，95℃變性15s，60-62℃退火15s；72℃延伸30s，共40個循環；

(5)統計分析

1)ISG15和RSAD2基因表達量的分析

采用相對定量的方法檢測目的基因的表達量：計算出檢測標本中目的基因與內參基因的閾值差(△Ct)，以表示樣品中目的基因mRNA相對表達量，將奶牛人工授精后0d各基因的相對表達量較正為1，人工授精后18d的表達量為0d時表達量的倍數；

2)利用牛ISG15和RSAD2基因的表達量進行奶牛早期妊娠診斷

人工授精后18d奶牛外周血中ISG15的表達量為X1，RSAD2的表達量為X2，將X1和X2帶入公式P＝1/[1+e^{-(-6.53+2.830X1+0.866X2)}]中，如果P值大于0.680時，即為妊娠。