[發(fā)明專利]輔助診斷阿爾茨海默病的檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410657145.9
• 申請(qǐng)日: 2014-11-18
• 公開（公告）號(hào): CN104328200A
• 公開（公告）日: 2015-02-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 段世偉;季慧慧;王欽文;劉桂利
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 寧波大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 寧波市天晟知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33219
• 代理人: 張文忠

1.輔助診斷阿爾茨海默病的檢測(cè)試劑盒，其特征是：所述的檢測(cè)試劑盒包含一對(duì)G蛋白偶聯(lián)受體基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化特異性擴(kuò)增引物及一個(gè)甲基化特異性測(cè)序引物，所述的一對(duì)G蛋白偶聯(lián)受體基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化特異性擴(kuò)增引物包括甲基化特異性上游引物和甲基化特異性下游引物：

所述的甲基化特異性上游引物包括以下核苷酸序列：

5’-GGGGATTTAGAGAGGTTGTAAAG?-3’；

所述的甲基化特異性下游引物包括以下核苷酸序列：

5’-Biotin-CCAACCTATAAACCCAACTAACTACTCTAC-3’；

所述的甲基化特異性測(cè)序引物包括以下核苷酸序列：

5’-?GGGATTTTTTTAGTTGTTAGTTAT-3’。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的輔助診斷阿爾茨海默病的檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法：其特征是：包括以下步驟：

步驟一：提取樣本的全血基因組DNA，并檢測(cè)所得DNA的濃度；

步驟二：采用甲基化試劑盒對(duì)樣本DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化；

步驟三：取步驟二中轉(zhuǎn)化過的DNA樣本20ng加入到Zymo?Taq^TM?PreMix酶，并加入一對(duì)G蛋白偶聯(lián)受體基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化特異性擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

步驟四：焦磷酸測(cè)序的前期準(zhǔn)備：在PSQ96板中預(yù)先加入45μl含有0.3μM甲基化特異性測(cè)序引物的退火緩沖液，將需要使用的混勻的瓊脂糖珠轉(zhuǎn)移到一個(gè)微量離心管中，在瓊脂糖珠中加入結(jié)合緩沖液混勻；將以上混合液加入PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中，將PCR產(chǎn)物在常溫下混勻10分鐘，使得磁珠與生物素結(jié)合；在真空預(yù)備工作站中，四個(gè)樣品板中依次加入180ml的高純水、70％乙醇、洗滌緩沖液和120ml的變性緩沖液；打開真空預(yù)備工作站的泵，將真空準(zhǔn)備工具在高純水中清洗30秒；然后將真空準(zhǔn)備工具移到PCR板中，抓取瓊脂糖珠；拿起PCR板，檢查是否大部分磁珠都被吸附在了真空準(zhǔn)備工具上；將真空準(zhǔn)備工具放入70％乙醇中5秒；然后移到變性緩沖液中5秒；再移到洗滌緩沖液中清洗5至10秒；關(guān)掉泵；將真空準(zhǔn)備工具放入含有甲基化特異性測(cè)序引物的板中，搖動(dòng)，釋放瓊脂糖珠；使用高純水清洗真空準(zhǔn)備工具；將放有樣品的PSQ96板放在加熱板上加熱到80℃?2分鐘，再冷卻到室溫；

步驟五：焦磷酸測(cè)序：在焦磷酸測(cè)序儀上，采用Pyromark?Gold?Q24試劑盒對(duì)步驟四中的PSQ96板中的樣本進(jìn)行測(cè)序，然后應(yīng)用PyroMark?CpG軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行甲基化分析。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的輔助診斷阿爾茨海默病的檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法：所述的步驟一中采用Lab-Aid?820全自動(dòng)核酸提取儀提取全血基因組DNA，再通過NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的輔助診斷阿爾茨海默病的檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法：所述的步驟二中采用EZ?DNA甲基化試劑盒。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的輔助診斷阿爾茨海默病的檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法：所述的步驟三中PCR擴(kuò)增條件為：首先95℃?10min的變性；接著95℃?30s，Tm?40s，72℃?50s，共35個(gè)循環(huán)的退火反應(yīng)；然后延伸反應(yīng)72℃?7min。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的輔助診斷阿爾茨海默病的檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法：所述的步驟五中焦磷酸測(cè)序儀采用PyroMark?Q24焦磷酸測(cè)序。