[發(fā)明專利]Cas9-scForkI融合蛋白及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410656091.4
• 申請日: 2014-11-18
• 公開（公告）號: CN104531633A
• 公開（公告）日: 2015-04-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李云英
• 申請（專利權(quán)）人: 李云英
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22;C12N15/62
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種Cas9-scForkI融合蛋白及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

CRISPR-Cas源自細(xì)菌和古細(xì)菌的免疫系統(tǒng)，可利用靶點特異性的RNA將Cas9核酸酶帶到基因組上的具體靶點，從而對特定基因位點進(jìn)行修飾。RNA導(dǎo)向Cas9可以在多種細(xì)胞和生物體中發(fā)揮功能，在特異位點裂解完整基因組。Cas9這種基因組編輯的潛能使這項技術(shù)已經(jīng)廣泛用于人的細(xì)胞系，小鼠，大鼠，多物種的基因敲除及敲入。

ForkI是一種限制性核酸內(nèi)切酶，F(xiàn)orkI二聚化后就可以對DNA進(jìn)行切割。已經(jīng)有文獻(xiàn)報道，失活的Cas9與ForkI融合，即Cas9-ForkI可用于基因組的編輯。而且Cas9-ForkI?nickase可以更精確的用于基因組的編輯。但是這兩個技術(shù)需要設(shè)計兩個gRNA靶向，設(shè)計比較復(fù)雜。而且Cas9-ForkI?nickase的切割效率也比較低。本發(fā)明用一個失活的Cas9蛋白連接兩個ForkI，這兩個ForkI由(G4S)₁₀連接，該方法設(shè)計比較簡單，只需要設(shè)計一個gRNA，而且切割活性很高。該方法更適用于介導(dǎo)基因敲入。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種Cas9-scForkI融合蛋白。本發(fā)明通過基因工程的辦法，把人源化Cas9蛋白進(jìn)行改造，用(G4S)₁₀即(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)₁₀是一個linker，由它連接兩個ForkI顯示，然后和失活的Cas9融合成Cas9-scForkI，該融合蛋白可以序列特異性的進(jìn)行基因組的編輯。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

Cas9-scForkI融合蛋白，所述融合蛋白為由SEQ?ID?NO.1所示氨基酸序列組成的蛋白。

編碼上述的Cas9-scForkI融合蛋白的核苷酸序列。

以上核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

所述的Cas9-scForkI融合蛋白，所述的Cas9蛋白是失活的Cas9。

所述的Cas9-scForkI融合蛋白，所述的scForkI蛋白是由兩個ForkI，中間由一個(G4S)₁₀連接。

所述的Cas9-scForkI融合蛋白在藥物篩選及基因修飾中的應(yīng)用。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果為：本發(fā)明通過基因工程的辦法，把失活的Cas9蛋白進(jìn)行改造，用(G4S)₁₀即(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)₁₀是一個linker，由它連接兩個ForkI，然后和失活的Cas9融合成Cas9-scForkI，該融合蛋白可以序列特異性的進(jìn)行基因組的編輯。本發(fā)明Cas9-scForkI融合蛋白做藥物篩選或基因修飾更安全，該融合蛋白還可用于基因治療。

本發(fā)明和現(xiàn)有技術(shù)相比較，設(shè)計更加靈活。而且切割活性更高，用作基因敲入的效率更高。蛋白不僅可以用于基因修飾，也可用于基因治療。

附圖說明

圖1為Cas9-scForkI蛋白活性的驗證圖；

圖2為Cas9-scForkI蛋白對Malt1基因切割活性驗證圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

本發(fā)明中，SEQ?ID?NO.8所示序列、引物Primer_F1?、引物Primer_?R1、Malt1基因的gRNA序列、引物Primer?F、引物Primer?R、引物Primer_F2和引物Primer_?R2，均購于生工生物工程（上海）股份有限公司；

膠回收采用膠回收試劑盒，購于天根生化科技(北京)有限公司；

hCas9載體購于Addgene，Plasmid?41815；

小鼠ES細(xì)胞，購于Millipore；

以SEQ?ID?NO.8所示合成Cas9-ForkI-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)10-ForkI?DNA序列是委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成的。

實施例1??Cas9-scForkI融合蛋白的制備