[發明專利]一種用于核酸分離和純化的磁流體的制備方法

在審

• 申請號: 201410656016.8
• 申請日: 2014-11-18
• 公開（公告）號: CN104450679A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發明（設計）人: 武守陽
• 申請（專利權）人: 成都理想財富投資咨詢有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

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技術領域

????本發明屬于磁性顆粒的制備領域，具體涉及一種用于核酸分離和純化的磁流體的制備方法。

背景技術

核酸是由許多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，為生命的最基本物質之一。根據化學組成不同，核酸可分為核糖核酸（簡稱RNA）和脫氧核糖核酸（簡稱DNA）。DNA?和RNA?在動植物種都有存在，但一種病毒只含有一種核酸，DNA?或RNA。核酸在整個分子生物學中的所具有的無可替代的作用，分子生物學創立以來，一直是分子生物學研究的主要對象。因此，核酸的提取和分離純化也是分子生物學各類實驗不可缺少的一個環節。

大腸桿菌作為外源基因表達的宿主，遺傳背景清楚，技術操作簡單，培養條件簡單，大規模發酵經濟，倍受遺傳工程專家的重視。目前大腸桿菌是應用最廣泛，最成功的表達體系，常做高效表達的首選體系。它的基因組DNA為擬核中的一個環狀分子,同時可以有多個環狀質粒DNA。正由于大腸桿菌的上述優點，人們在利用大腸桿菌表達外源基因時，常常有質粒提取的操作。目前人們常用的質粒提取的方法是采用酚氯仿抽提質粒DNA，然后用異丙醇或乙醇沉淀，此方法中需要用到酚氯仿這些有毒物質，對實驗操作人員造成潛在危害。為改善實驗人員的工作環境，目前人們采用商業的DNA回收柱來進行質粒提取，此類DNA回收柱價格昂貴，回收柱的使用是一次性的，造成大量實驗室固體垃圾。

在基因克隆實驗中，也常常將基因通過擴增后，從瓊脂糖凝膠中回收目的基因。從瓊脂糖凝膠中回收的方法很多，如陰離子交換色譜純化、電洗脫至透析袋、有機溶劑抽提、瓊脂糖酶消化、柱式樹脂吸附系統回收等，方便快捷的回收方法及較高的回收效率在分子克隆中是十分重要的。采用市售回收試劑盒，價格較昂貴，且回收效率不穩定；并且回收柱是一次性的，造成大量的生物實驗耗材垃圾；目前市場上的DNA回收柱的容積一般是2mL，當需要大量回收DNA時，需要操作人員用多個回收柱進行回收，不僅造成實驗成本高，并且提高操作人員的工作量。

方便快捷的核酸分離和純化方法，在基因遺傳工程中十分重要。利用磁流體分離和純化核酸具有以下好處：磁性粒子具有超順磁性,?在磁場中有較強的磁性,?去掉磁場后磁性很快消失,?在磁場中不被永久磁化,?故可在外加磁場(如磁鐵)作用下,?快速、方便地分離和純化目標核酸。目前的磁流體制備成本高，磁性粒子在緩沖溶液中的穩定性差，放置1個月、甚至幾天后，其分離和純化效果降低，這些都限制了磁流體在核酸分離和純化操作中的廣泛使用。

發明內容

為解決上述問題，本發明提供一種用于核酸分離和純化的磁流體的制備方法，制備而成的磁流體磁響應性好，在不同緩沖液中對核酸的吸附和解吸效果佳，能方便迅速地實現核酸的分離或純化。本發明采用如下技術方案：

????一種用于核酸分離和純化的磁流體的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

a、將氯化鐵、氯化亞鐵和氨水分別配制成水溶液，然后攪拌混合，得到混合液A；

b、向混合液A中逐滴加入油酸，繼續攪拌3~10h，得到黑色溶液A，用外加磁場從黑色溶液A中分離得到黑色固體A；

c、將黑色固體A分散在去離子水中，加入聚醚酰亞胺，超聲振蕩5~12h，得到黑色溶液B，用外加磁場從黑色溶液B中分離得到黑色固體B；

d、將黑色固體B分散在去離子水中，即得所述的磁流體。

優選地，步驟a中所述的氯化鐵、氯化亞鐵和氨水的水溶液的混合比例按溶質的摩爾份數計，為2：1：8。

優選地，步驟a中所述的攪拌混合時間為5~10h；所述的攪拌混合的同時采用油浴加熱，加熱溫度為30~50℃。

????優選地，步驟b中所述的用外加磁場從黑色溶液A中分離得到黑色固體A包括以下內容：從黑色溶液A中用外加磁場收集固體后，用無水乙醇清洗固體2~3次，然后用去離子水清洗固體直到清洗液的pH=6.7~7，用外加磁場收集固體，即為所述的黑色固體A。

優選地，步驟d中所述磁流體的濃度為2~50mg/ml。

本發明的有益效果如下：

1.?本發明提供的用于核酸分離和純化的磁流體的制備方法中，采用油酸對四氧化三鐵表面進行修飾，對納米粒子進行包覆，使外表面形成保護層阻止粒子團聚，使制備而成的磁流體粒徑為納米級的，在溶液中的分散性好，增大與核酸的接觸面積。

2.?本發明提供的用于核酸分離和純化的磁流體的制備方法中，采用聚醚酰亞胺對磁性粒子進行表面改性，得到表面有氨基修飾的磁性粒子，便于對核酸的分離和純化。