[發(fā)明專(zhuān)利]一種SAMHD1基因敲除細(xì)胞系的構(gòu)建方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410654987.9
• 申請(qǐng)日: 2014-11-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104450784A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-03-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 靳昌忠;吳南屏
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/85
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/85
• 代理公司: 杭州求是專(zhuān)利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 邱啟旺

1.一種SAMHD1基因敲除細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）針對(duì)SAMHD1基因的CDS1選取作用靶點(diǎn)，并設(shè)計(jì)2對(duì)識(shí)別序列，分別為L(zhǎng)1/R1、L2/R2；針對(duì)SAMHD1基因的CDS2選取作用靶點(diǎn)，并設(shè)計(jì)2對(duì)識(shí)別序列，分別為L(zhǎng)3/R3、L4/R4；L1~L4的序列如SEQ?ID?NO.17~SEQ?ID?NO.20所示，R1~R4的序列如SEQ?ID?NO.21~SEQ?ID?NO.24所示；

（2）將靶點(diǎn)識(shí)別單元模塊的基因片段分別按照L1/R1、L2/R2、L3/R3、L4/R4序列進(jìn)行串聯(lián)，串聯(lián)成功后克隆入pCAG-T7-TALEN(Sangamo)-?Destination質(zhì)粒，共構(gòu)建4對(duì)TALEN表達(dá)質(zhì)粒對(duì)；其中，靶點(diǎn)識(shí)別單元模塊的基因片段按照L1序列進(jìn)行串聯(lián)后對(duì)應(yīng)的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.9所示；按照R1序列進(jìn)行串聯(lián)后對(duì)應(yīng)的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.10所示；按照L2序列進(jìn)行串聯(lián)后對(duì)應(yīng)的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.11所示；按照R2序列進(jìn)行串聯(lián)后對(duì)應(yīng)的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.12所示；按照L3序列進(jìn)行串聯(lián)后對(duì)應(yīng)的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.13所示；按照R3序列進(jìn)行串聯(lián)后對(duì)應(yīng)的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.14所示；按照L4序列進(jìn)行串聯(lián)后對(duì)應(yīng)的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.15所示；按照R4序列進(jìn)行串聯(lián)后對(duì)應(yīng)的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.16所示；

（3）將構(gòu)建好的4對(duì)TALEN表達(dá)質(zhì)粒對(duì)分別用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染到表達(dá)SAMHD1的293T細(xì)胞系中，48小時(shí)后將細(xì)胞在含有濃度為100ug/ml的新霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)10-14天，篩選出活細(xì)胞，得到敲除SAMHD1基因的細(xì)胞系。