[發(fā)明專利]F85-20蛋白及其編碼基因及其作為β-葡萄糖苷酶的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410654095.9
• 申請日: 2014-11-17
• 公開（公告）號: CN104388409A
• 公開（公告）日: 2015-03-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳曉磊;王蒙;來國莉;聶勇;耿爽
• 申請（專利權(quán)）人: 北京大學
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N15/70;C12N1/21
• 代理公司: 北京紀凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;白艷

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種F85-20蛋白及其編碼基因及其作為β-葡萄糖苷酶的應(yīng)用。

背景技術(shù)

據(jù)統(tǒng)計，每年全球植物通過光合作用合成纖維類物質(zhì)達到50億噸。纖維素(Cellulose)是植物細胞壁的重要組分，是自然界中最豐富的可再生資源。纖維素酶(Cellulase)是一類能將纖維素水解為低聚葡萄糖及葡萄糖的酶，很多自然界微生物均含有纖維素酶。由于纖維素酶可以廣泛應(yīng)用于紡織、造紙、食品及生物燃料等工業(yè)，近年來吸引了越來越多學者的研究興趣。然而，在纖維素酶水解的過程中，產(chǎn)生的大量纖維二糖及寡糖會強烈抑制纖維素酶的活性，導致纖維素水解效率的急劇下降，整個生產(chǎn)效率的降低。β-葡萄糖苷酶可以高效催化纖維二糖及寡糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖，因此將該酶加至纖維素酶中，會解除產(chǎn)物抑制，使纖維素酶恢復高效力，從而保證整個水解過程連續(xù)而穩(wěn)定。

工業(yè)中，纖維素的水解溫度一般為50℃，很少有酶在該溫度下保持比較長時間的催化效力及穩(wěn)定性。這就限制了生物燃料工業(yè)的高效發(fā)展，也是制約生物燃料降低生產(chǎn)成本的重要因素。為了使酶達到較高的耐熱性及熱穩(wěn)定性，很多學者從嗜熱微生物中篩選新酶，但是它們很少可以適用在工業(yè)條件中。自然界中，不可培養(yǎng)微生物約占所有微生物的99％。大部分篩選β-葡萄糖苷酶的研究仍然禁錮在可培養(yǎng)的1％的微生物中。近10年來，隨著測序技術(shù)與高通量篩選技術(shù)的發(fā)展，人們逐漸開始研究不可培養(yǎng)微生物中蘊含的資源，采用的是日臻成熟的宏基因組技術(shù)，并發(fā)現(xiàn)了大量具有優(yōu)秀性質(zhì)的酶，說明了宏基因組技術(shù)發(fā)掘新酶的廣闊前景。

在宏基因組技術(shù)篩選新酶的研究中，篩選效率從土壤等自然環(huán)境到動物消化道，再到人工馴化的反應(yīng)器依次遞增。這與馴化的強度及選擇壓力是相關(guān)的。在自然環(huán)境中，比如森林土壤，需要若干年，微生物才能將生物質(zhì)降解，在動物消化道中，這種反應(yīng)需要若干天，但是水解效率依舊不高，這就是食草動物食量大的原因；而對于人工馴化的反應(yīng)器，三天即可達到90％的轉(zhuǎn)化率。本研究從人工馴化反應(yīng)器中篩選β-葡萄糖苷酶，保證了其高效性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個目的是提供一種蛋白。

本發(fā)明提供的蛋白，F(xiàn)85-20，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)：

1)由序列表中序列2所示的氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；

2)將1)所示的蛋白質(zhì)的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白質(zhì)。

上述經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。

編碼上述蛋白的DNA分子也是本發(fā)明保護的范圍。

上述DNA分子為如下1)-5)中任一所述的DNA分子：

1)編碼區(qū)為序列表中序列1；

2)編碼區(qū)為序列表中序列1自5’末端第19-1404位核苷酸；

3)編碼區(qū)為序列表中序列1自5’末端第11-1404位核苷酸；

4)在嚴格條件下與1)或2)或3)雜交且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子；

5)與1)或2)或3)具有90％以上同源性且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子。

上述嚴格條件可為用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA雜交實驗中65℃下雜交并洗膜。

含有上述DNA分子的表達盒、重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌也是本發(fā)明保護的范圍。

上述方法中，所述表達載體為pET-28a載體，所述重組載體在本發(fā)明的實施例為將序列表中序列1自5’末端第11-1404位核苷酸插入pET-28a載體的Nco?I與Hind?III酶切位點間得到的載體；

上述重組載體為將上述DNA分子插入表達載體得到的重組載體。

上述重組菌為將所述重組載體導入目的菌中得到的重組菌。

所述目的菌為大腸桿菌，具體為BL21DE3。

上述蛋白在作為β-葡萄糖苷酶或纖維素酶或木糖苷酶中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍。

上述的蛋白或上述DNA分子或上述的表達盒、重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌在制備β-葡萄糖苷酶或纖維素酶或木糖苷酶中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍。

所述β-葡萄糖苷酶的酶學特征具體為：最適pH值為6.0，最適溫度為65℃。