[發(fā)明專利]冬蟲夏草中國(guó)被毛孢合成乙酸的酶、基因及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410653007.3
• 申請(qǐng)日: 2012-10-30
• 公開（公告）號(hào): CN104388400A
• 公開（公告）日: 2015-03-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭裕國(guó);柳志強(qiáng);吳暉;李邦良;許靜;林善;許峰;薛亞平;袁水金;王鴻艷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué);杭州中美華東制藥有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/00
• 分類號(hào): C12N9/00;C12N15/52;C12P7/54;C12N15/70
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種來(lái)自“百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國(guó)被毛孢的參與乙酰輔酶A出發(fā)合成代謝乙酰基-酰基載體蛋白的脂肪-酰基輔酶A合酶(Acyl-coenzyme?A?synthetase)，編碼這個(gè)酶的基因及其應(yīng)用，乙酰基-酰基載體蛋白可再經(jīng)過(guò)水解生成乙酸。

(二)背景技術(shù)

冬蟲夏草(Cordyceps?sinensis(Berk.)Sacc.)是冬蟲夏草菌寄生在鱗翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆蟲(Hepialus?armoricanus?Oberthur)幼蟲上的子座及幼蟲尸體上的復(fù)合體(包括子座和蟲體)。冬蟲夏草是一類珍惜的傳統(tǒng)真菌藥材資源，具有代謝產(chǎn)物和生物活性多樣的特點(diǎn)，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用和發(fā)展前景。冬蟲夏草以其多種藥用功效廣泛、明顯而備受關(guān)注，在世界范圍內(nèi)備受推崇。中醫(yī)認(rèn)為，冬蟲夏草入肺腎二經(jīng)，既能補(bǔ)肺陰，又能補(bǔ)腎陽(yáng)，主治腎虛，陽(yáng)痿遺精，腰膝酸痛，病后虛弱，久咳虛弱，勞咳痰血，自汗盜汗等，是唯一的一種能同時(shí)平衡、調(diào)節(jié)陰陽(yáng)的中藥。現(xiàn)代藥理學(xué)已證實(shí)，冬蟲夏草具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素樣作用等廣泛的生物活性。

冬蟲夏草菌是一種子囊菌，在其生活史中具有分生孢子階段(無(wú)性型)和子囊孢子階段(有性型)。而在人工培養(yǎng)、液體發(fā)酵等實(shí)際生產(chǎn)中使用的是無(wú)性階段的冬蟲夏草菌，因而冬蟲夏草無(wú)性型的鑒定非常重要。國(guó)內(nèi)外學(xué)者在冬蟲夏草資源調(diào)查、無(wú)性型確證、活性成分分離分析和作用機(jī)理、開發(fā)應(yīng)用方面做了大量工作。冬蟲夏草中國(guó)被毛孢已被證明是冬蟲夏草的無(wú)性型存在形式，具有與天然冬蟲夏草相同的活性成分和藥效。

天然蟲草具有嚴(yán)格的寄生性以及特殊的生態(tài)環(huán)境，故其產(chǎn)量很低，價(jià)格高昂。野生冬蟲夏草由于受生長(zhǎng)環(huán)境等因素制約，資源匱乏。由于近幾年在人工栽培上進(jìn)展不大，野生冬蟲夏草代用品研究多集中在液體發(fā)酵上。利用液體深層發(fā)酵培養(yǎng)冬蟲夏草菌絲體、提取物或發(fā)酵液,是解決冬蟲夏草藥源的一種有效途徑。蟲草發(fā)酵生產(chǎn)蟲草替代品，既可有效保護(hù)蟲草這一珍貴資源，又不受氣候、地理環(huán)境和蟲草寄生條件嚴(yán)格的限制，適合于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。生產(chǎn)出的替代品如菌絲體其成分和藥效也與天然蟲草相似，因而國(guó)內(nèi)外一直致力于蟲草菌絲體的發(fā)酵培養(yǎng)。人工發(fā)酵培養(yǎng)冬蟲夏草中國(guó)被毛孢得到的菌絲，經(jīng)毒理、藥理、植化研究，證明與天然蟲草化學(xué)組成、藥理作用基本一致，可代替天然蟲草生產(chǎn)蟲草制品，以彌補(bǔ)自然資源的短缺，通過(guò)對(duì)發(fā)酵條件的優(yōu)化，菌絲體生物量和代謝產(chǎn)物的量均有明顯提高。

近年來(lái)，隨著天然產(chǎn)物化學(xué)和現(xiàn)代色譜技術(shù)的飛速發(fā)展，在對(duì)蟲草產(chǎn)品研發(fā)中已逐步由蟲草原料或粗提物的直接利用轉(zhuǎn)向更深層次的功能性代謝產(chǎn)物研究。國(guó)內(nèi)外已對(duì)蟲草代謝產(chǎn)物做了大量的研究，代謝產(chǎn)物主要包括核苷、多糖、多肽、甾醇等幾大類化合物，其中嘌呤類核苷、蟲草多糖、甘露醇等具有代表性的功能性代謝產(chǎn)物在生物合成、藥理作用等方面的研究初見成效。

不飽和脂肪酸是指分子中含有一個(gè)或多個(gè)雙鍵的脂肪酸，其熔點(diǎn)較飽和脂肪酸低。不飽和脂肪酸是構(gòu)成體內(nèi)脂肪的一種脂肪酸，人體必需的脂肪酸，不飽和脂肪酸根據(jù)雙鍵個(gè)數(shù)的不同，分為單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸二種。多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated?Fatty?Acids，PUFAs)相對(duì)飽和脂肪酸來(lái)說(shuō)具有更多的功效，它可以降低血中膽固醇和甘油三酯，調(diào)節(jié)心臟功能，降低血液黏稠度，改善血液微循環(huán)，提高腦細(xì)胞的活性，增強(qiáng)記憶力和思維能力，增強(qiáng)人體防御系統(tǒng)的功能等，此外它還可以排除人體內(nèi)多余的“垃圾”，也就是由于攝人了過(guò)量的飽和脂肪酸形成的多余脂肪，從而達(dá)到減肥的目的。因此，其潛在的醫(yī)用藥用價(jià)值受到了世界的廣泛關(guān)注，引起了食品、醫(yī)藥甚至化妝品等行業(yè)的高度重視。

1999年Yung-Sheng引克隆了高山被孢霉(Mortiere?Uaalpina)的△6和△12脂肪酸脫氫酶基因并在釀酒酵母中進(jìn)行了表達(dá)。2004年，Dyer等人將桐樹中的△3去飽和酶轉(zhuǎn)入酵母，成功地獲得了產(chǎn)亞麻酸的酵母菌。2007年Maali-Amiri等人將藻青菌(Cyanobacterium)的△12去飽和酶轉(zhuǎn)入馬鈴薯，成功檢測(cè)到馬鈴薯脂肪酸成分發(fā)生了明顯變化。2008年，Hao等人將卷枝毛霉的△6去飽和酶轉(zhuǎn)人轉(zhuǎn)基因煙草中，成功獲得了高產(chǎn)γ-亞麻酸的菌株。此外，還有許多脂肪酸去飽和酶相關(guān)的基因被克隆并轉(zhuǎn)化應(yīng)用。由于大部分去飽和酶為膜結(jié)合蛋白，其分離純化十分困難，已經(jīng)分離純化并鑒定的去飽和酶屈指可數(shù)，而絕大多數(shù)的研究是圍繞去飽和酶基因及其表達(dá)調(diào)控來(lái)進(jìn)行的。