[發明專利]一種分泌抗金剛烷胺單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其應用

有效

• 申請號: 201410652559.2
• 申請日: 2014-11-17
• 公開（公告）號: CN104480072A
• 公開（公告）日: 2015-04-01
• 發明（設計）人: 錢鳴蓉;蘇娟;楊華;張巧艷;汪建妹;邵越水;肖英平;鄭孝君;陳東
• 申請（專利權）人: 浙江省農業科學院;杭州傲銳生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/40;G01N33/577;G01N33/68;C12R1/91
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種分泌抗金剛烷胺單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其應用。

背景技術

金剛烷胺可以抑制病毒繁殖，臨床上用于預防和治療各種A型流感病毒的感染。但由于經濟利益驅使和疫病防控的壓力，我國目前家禽飼養中存在濫用金剛烷胺的現象。金剛烷胺的殘留蓄積會對食用者產生嗜睡、失眠、眩暈、抑郁、惡心等癥狀；長期使用還將使禽流感等病毒產生耐藥性，誘導產生新型耐藥病毒。

然而，2012年11月媒體曝出國內養殖的“速生雞”從孵出到端上餐桌只需45天，不法商販為了保證其存活，給雞喂養了大劑量人用藥物來抑制禽類的禽流感等病癥。2012年12月，央視調查中稱，一些養殖戶為進一步縮短養殖周期，讓原本已經是速成品種的白羽雞長得更快，偷偷喂食違禁藥物，其中包括金剛烷胺等抗病毒藥品和地塞米松等激素類藥品。“速成雞”事件的爆發引發了全國消費者對禽肉食品安全的廣泛關注和擔憂，對建立快速、靈敏、準確的檢測技術提出了迫切需求。

目前，對金剛烷胺的檢測主要依靠高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、薄層色譜法(TLC)、質譜法(MS)等，但是存在儀器昂貴，檢測費時的缺陷，并且需要專業技術人員進行操作，不能達到現代檢測對快速、準確的要求。

免疫分析法可以彌補以上所有缺點，免疫分析法是一種利用抗原抗體特異性結合反應檢測各種物質(藥物、激素、蛋白質、微生物等)的分析方法，建立小分子化合物的免疫分析方法的關鍵是能夠制造出對小分子化合物具有高親和力和高特異性的抗體。近年來，美國已開發了用于檢測金剛烷胺的酶聯免疫試劑盒，但檢測成本較高，操作相對復雜。

雜交瘤技術能有效制備單克隆抗體，其原理是利用聚乙二醇為細胞融合劑，使免疫的小鼠脾細胞與具有體外長期繁殖能力的小鼠骨髓瘤細胞融為一體，在HAT選擇性培養基的作用下，只讓融合成功的雜交瘤細胞生長，經過反復的免疫學檢測、篩選和單個細胞培養(克隆化)，最終獲得既能產生所需單克隆抗體，又能長期繁殖的雜交瘤細胞系。將這種雜交瘤細胞擴大培養，接種于小鼠腹腔，在小鼠腹腔積液中即可得到高效價的單克隆抗體。

雜交瘤技術制備單克隆抗體的核心是獲得理想的雜交瘤細胞株，但現有技術中還未有能分泌抗金剛烷胺單克隆抗體的雜交瘤細胞株。

發明內容

本發明提供了一種分泌抗金剛烷胺單克隆抗體的雜交瘤細胞株，該雜交瘤細胞株能產生高效價的抗金剛烷胺單克隆抗體。

一種分泌抗金剛烷胺單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為雜交瘤細胞株7G4.3，已于2014年9月25日保藏于中國典型培養物保藏中心(China?Center?for?Type?Culture?Collection，簡稱CCTCC)，保藏編號為CCTCC?No.C2014169；中國典型培養物保藏中心的地址為：湖北省武漢市武昌區武漢大學保藏中心(武漢大學第一附屬小學對面)。

本發明采用小劑量肌肉注射免疫方法和腹腔免疫相結合的方法，利用金剛烷胺人工抗原注射小鼠，獲得免疫的小鼠脾細胞，進而將免疫的小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合，從而獲得所述雜交瘤細胞株。

金剛烷胺本身的分子量太小，不具有免疫原性，即缺乏T細胞表位而無法直接誘導動物機體產生特異性抗體，因此本發明對金剛烷胺進行化學修飾，獲得能誘導B細胞的增殖和分化繼而產生特異性抗體的金剛烷胺人工抗原。所述金剛烷胺人工抗原的分子結構式如式(Ⅰ)所示：

式(Ⅰ)中，BGG為牛丙種球蛋白。

每次注射時，金剛烷胺人工抗原的用量為10μg。

采用小劑量肌肉注射免疫方法和腹腔免疫相結合的方法免疫小鼠，免疫效價高。

本發明還提供了所述雜交瘤細胞株在制備金剛烷胺檢測試劑盒中的應用；提供了所述雜交瘤細胞株在制備用于檢測金剛烷胺的試紙條中的應用。

將所述雜交瘤細胞株擴大培養，接種于小鼠腹腔，在小鼠腹腔積液中可得到高效價的抗金剛烷胺單克隆抗體，利用該抗金剛烷胺單克隆抗體可用于制備金剛烷胺檢測試劑盒。

本發明還提供了一種抗金剛烷胺單克隆抗體，由所述雜交瘤細胞株或其傳代細胞株分泌產生。

本發明還提供了所述抗金剛烷胺單克隆抗體在檢測金剛烷胺中的應用。

本發明還提供了一種金剛烷胺的檢測試劑盒，含有所述的抗金剛烷胺單克隆抗體。