[發(fā)明專利]一種對蝦白斑癥病毒半定量快速檢測試紙及其制備方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201410652371.8
• 申請日: 2014-11-16
• 公開（公告）號: CN104360068A
• 公開（公告）日: 2015-02-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 繩秀珍;張玲;唐小千;戰(zhàn)文斌;邢婧
• 申請（專利權(quán)）人: 中國海洋大學(xué)
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/569;G01N33/558
• 代理公司: 青島海昊知識產(chǎn)權(quán)事務(wù)所有限公司 37201
• 代理人: 王鐸

1.一種用于對蝦白斑癥病毒檢測的單克隆抗體，其特征在于所述單克隆抗體包括抗WSSV的不同表位的單抗A和單抗B，分別是由兩株名稱為：雜交瘤細胞株WSSV-K1、WSSV-K2，保藏號分別為：CCTCC?NO：C2014160和CCTCC?NO：C2014161，保藏單位為：中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：湖北省武漢市武漢大學(xué)，保藏日期：2014年9月2日的雜交瘤細胞分泌所得。

2.一種對蝦白斑癥病毒半定量快速檢測試紙，其特征在于所述半定量快速檢測試紙包括權(quán)利要求1所述的單抗A和單抗B。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的半定量快速檢測試紙，其特征在于所述半定量快速檢測試紙還包括載體板、樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述樣品墊和吸水墊位于載體板的兩端，硝酸纖維素膜位于載體板的中部；所述樣品墊與硝酸纖維素膜交界處設(shè)有載有金標(biāo)單抗A的金標(biāo)墊，金標(biāo)墊一端邊緣重疊在樣品墊之下，另一端邊緣重疊在硝酸纖維素膜之上；硝酸纖維素膜上設(shè)有依次排列的三條檢測線T1、T2、T3和一條質(zhì)控線，所述的三條檢測線包被有不同濃度的單抗B，T1、T2、T3上單抗B的濃度自金標(biāo)墊側(cè)依次降低；靠近吸水墊的質(zhì)控線包被有羊抗小鼠IgG。

4.一種如權(quán)利要求3所述對蝦白斑癥病毒半定量快速檢測試紙的制備方法，其特征在于它包括如下步驟：

（1）單抗A和單抗B的制備與純化

復(fù)蘇并培養(yǎng)分泌抗WSSV單抗的雜交瘤細胞株WSSV-K1和WSSV-K2，分別腹腔注射BALB/c小鼠，采集腹水，辛酸-硫酸銨法提純獲得抗WSSV單抗A和單抗B；

（2）金標(biāo)墊的制備

①膠體金及金標(biāo)單抗A的制備：

采用微波爐-檸檬酸三鈉還原法制得顆粒大小為20～30?nm的膠體金，用0.1?mol/L碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)膠體金pH值為8.2；將抗WSSV單抗A按合適的比例加入膠體金中，再加入牛血清白蛋白（BSA），離心純化后用金標(biāo)保存液懸起，即為金標(biāo)單抗A液體；

②載有金標(biāo)單抗A的金標(biāo)墊的制備：

將制成的金標(biāo)單抗A液體噴涂到玻璃纖維上，冷凍干燥；

（3）硝酸纖維素膜的制備

分別將3份不同濃度的抗WSSV單抗B按照濃度依次降低順序噴涂于硝酸纖維素膜作為檢測線T1、T2、T3，將羊抗小鼠IgG噴涂于硝酸纖維素膜作為質(zhì)控線，晾干，于封閉液中浸泡；

（4）對蝦WSSV半定量快速檢測試紙的制作

在載體板上依次貼上硝酸纖維素膜、吸水墊、金標(biāo)墊和樣品墊，切條，即成本發(fā)明試紙。

5.一種對蝦白斑癥病毒半定量快速檢測試紙的檢測方法，其特征在于它包括以下步驟：

（1）待檢樣品的制備

取患白斑病的對蝦鰓，每1?g蝦鰓加入5?mL?TNE緩沖液（Tris-HCl?1.566?g，NaCl?5.844?g，EDTA-Na₂?0.372?g，H₂O?1?000?mL，pH為7.5）配制的25%蔗糖溶液，冰浴充分研磨3~5?min，將研磨液利用紗絹過濾，取上清作為待檢樣品液；

（2）對蝦白斑癥病毒半定量檢測

將試紙的樣品墊一端浸入檢測樣品中約10s，浸入深度約0.5cm，水平放置10min后，肉眼觀察檢測結(jié)果，根據(jù)檢測線T1、T2、T3顯色情況定量病毒含量；檢測線T1、T2、T3和質(zhì)控線都顯現(xiàn)紅色時，WSSV濃度≥6.26μg/ml；檢測線T1、T2和質(zhì)控線顯現(xiàn)紅色，3.13μg/ml≤WSSV濃度＜6.26μg/ml；檢測線T1和質(zhì)控線顯現(xiàn)紅色，783ng/ml≤WSSV濃度＜3.13μg/ml；只有質(zhì)控線顯現(xiàn)紅色，表明WSSV濃度小于783ng/ml或者不含WSSV。