[發(fā)明專利]一種山藥原生質(zhì)體的制備及純化方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410652045.7
• 申請(qǐng)日: 2014-11-18
• 公開（公告）號(hào): CN104357376A
• 公開（公告）日: 2015-02-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張敏躍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 張敏躍
• 主分類號(hào): C12N5/04
• 分類號(hào): C12N5/04
• 代理公司: 南京蘇科專利代理有限責(zé)任公司 32102
• 代理人: 陳忠輝

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及原生質(zhì)體的制備、純化，具體涉及一種山藥原生質(zhì)體的制備及純化方法，屬于植物組織培養(yǎng)和細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

原生質(zhì)體是植物細(xì)胞去除細(xì)胞壁后的產(chǎn)物，具有該細(xì)胞的所有生命特性，可應(yīng)用于植物細(xì)胞發(fā)育學(xué)、生理學(xué)、病毒學(xué)等諸多方面的研究，如可利用原生質(zhì)體研究細(xì)胞壁再生、細(xì)胞器攝入、細(xì)胞分裂等植物生理學(xué)課題。由于排除了細(xì)胞壁的障礙，易于導(dǎo)入外源基因，原生質(zhì)體也被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因研究，特別是在遺傳育種方面，原生質(zhì)體是最基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)材料。山藥研究在我國相對(duì)薄弱，山藥原生質(zhì)體制備工作尚未見報(bào)道。通常，植物的很多器官，如根、莖、葉、子葉、愈傷組織和培養(yǎng)細(xì)胞等，都可以用來制備原生質(zhì)體。但要獲得易于分離、產(chǎn)量高、生物活性好的原生質(zhì)體，選擇合適起始材料是原生質(zhì)體培養(yǎng)成功的關(guān)鍵因素之一。已有報(bào)道不同植物原生質(zhì)體的制備方法，但針對(duì)特定的植物原生質(zhì)體的制備，必須根據(jù)不同外植體的特性，借鑒以往的方法并加以改良、優(yōu)化。為避免污染，以往的方法多利用組織培養(yǎng)苗的外植體，愈傷組織、或懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制備無菌原生質(zhì)體。但這些做法所需的時(shí)間較長，耗費(fèi)很多材料和精力。且最大的缺陷是材料來源有限。以往的原生質(zhì)體在純化過程中，一般通過離心方式，難以去除酶解產(chǎn)物中大量的細(xì)胞碎片，且過多的離心容易造成對(duì)脆弱的原生質(zhì)體活性的損害。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種山藥原生質(zhì)體的制備及純化方法，使原生質(zhì)體制備時(shí)間縮短，并能保證原生質(zhì)體產(chǎn)量和質(zhì)量。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種山藥原生質(zhì)體的制備及純化方法，首先選取山藥幼葉，消毒處理；然后將葉片切成細(xì)條放入酶解液中，在黑暗條件下酶解去除細(xì)胞壁；接著將酶解混合物在水平搖床上處理，使原生質(zhì)體充分釋放；用尼龍網(wǎng)膜將酶解混合物過濾至離心管中，將過濾產(chǎn)物離心后棄上清；加入洗滌液，輕緩顛倒使細(xì)胞懸浮；離心分離原生質(zhì)體，去上清；再加入原生質(zhì)體保存液，重新懸浮細(xì)胞后靜置，使原生質(zhì)體自然沉降；最后吸取上層細(xì)胞懸液，得到純化的山藥原生質(zhì)體。

進(jìn)一步地，本發(fā)明所述的一種山藥原生質(zhì)體的制備及純化方法，包括下列步驟：

①選取山藥幼葉，進(jìn)行消毒處理；

②原生質(zhì)體的制備：將葉片切成0.5mm的細(xì)條后，放入酶解液中，置于黑暗條件下，25℃酶解2h；

③原生質(zhì)體的純化：將酶解混合物在水平搖床上以80r/min搖5min，用45μm的尼龍網(wǎng)膜將酶解混合物過濾至離心管中，100g離心5min，棄上清；再加入適量洗滌液，輕緩顛倒懸浮細(xì)胞，100g離心5min，棄上清；再加入適量原生質(zhì)體保存液，重懸浮后，放置20min，讓原生質(zhì)體自然沉降，吸取上層細(xì)胞懸液，棄沉淀，得到純化的山藥原生質(zhì)體。

更進(jìn)一步地，對(duì)山藥幼葉消毒的方法是：自來水沖洗10min，75％乙醇浸泡30s，用無菌去離子水漂洗兩次，1：25巴氏消毒液浸泡20min，用無菌去離子水漂洗兩次。

更進(jìn)一步地，所述酶解液配方為：1.5％纖維素酶R-10，0.4％果膠酶，0.4M甘露醇，20mM?KCl，20mM?MES，10mM?CaCl₂，0.1％BSA。

再進(jìn)一步地，所述原生質(zhì)體洗滌液配方:150mM?NaCl，120mM?CaCl₂、5mM?KCl、2mM?MES(pH5.8)。

本發(fā)明的有益效果是：(1)利用大田栽培植株的葉片制備原生質(zhì)體，材料容易獲得；(2)消毒方法對(duì)外植體的損傷較小，消毒效果好，污染率低；(3)針對(duì)山藥葉片的特性優(yōu)化了酶解體系和條件，獲得的原生質(zhì)體產(chǎn)量大，活性高；(4)自然沉降的方法可減少細(xì)胞碎片等雜質(zhì)，獲得較高純度的原生質(zhì)體；同時(shí)本發(fā)明對(duì)原生質(zhì)體的損傷比較小，盡可能保留了原生質(zhì)體的活性，為提高后續(xù)實(shí)驗(yàn)的成功率提供了保障。

附圖說明

圖1(圖1a和圖1b)為采用傳統(tǒng)離心法與本發(fā)明的自然沉降法獲得的山藥原生質(zhì)體可見光照片比對(duì)；

圖2(圖2a和圖2b)為采用傳統(tǒng)離心法與本發(fā)明的自然沉降法獲得的山藥原生質(zhì)體(與圖1相同視野)經(jīng)二乙酸熒光素(FDA)染色后的熒光照片比對(duì)。

具體實(shí)施方式