[發(fā)明專利]一種單糖起始的多酶偶聯(lián)合成透明質(zhì)酸的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201410649819.0
• 申請日: 2014-11-14
• 公開（公告）號: CN104357517A
• 公開（公告）日: 2015-02-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 房俊強;王鵬;王帥帥;付玄
• 申請（專利權(quán)）人: 山東大學(xué)
• 主分類號: C12P19/26
• 分類號: C12P19/26
• 代理公司: 濟南圣達知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37221
• 代理人: 李健康

1.一種單糖起始的多酶偶聯(lián)合成透明質(zhì)酸的方法，步驟是：

(1)使用濃度為0.05M～0.5M、pH值為5.5～8.0的磷酸鹽緩沖液分別配制濃度為0.1M的N-乙酰氨基葡萄糖溶液和濃度為0.1M葡萄糖醛酸溶液，備用；

(2)使用濃度為0.05M～0.5M、pH值為5.5～8.0的磷酸鹽緩沖液分別配制濃度為0.1M的腺苷三磷酸(ATP)溶液和濃度為0.1M的尿苷三磷酸(UTP)溶液，備用；

(3)使用濃度為0.05M～0.5M、pH值為6.5～8.0的磷酸鹽緩沖液分別配制濃度均為50mg/mL的N-乙酰氨基葡萄糖激酶溶液、葡萄糖醛酸激酶溶液、N-乙酰氨基葡萄尿苷轉(zhuǎn)移酶溶液、葡萄糖醛酸尿苷轉(zhuǎn)移酶溶液、透明質(zhì)酸合酶溶液，備用；

(4)將步驟(1)、(2)中制得的0.1M的N-乙酰氨基葡萄糖溶液、0.1M的腺苷三磷酸(ATP)溶液與0.1M的尿苷三磷酸(UTP)溶液按體積比1:1～3:1～2混合，30±1℃水浴中孵育10±2分鐘，再加入孵育時混合液體積35～65％的步驟(3)中制得的50mg/mL?N-乙酰氨基葡萄糖激酶溶液與50mg/mL?N-乙酰氨基葡萄尿苷轉(zhuǎn)移酶溶液按體積比1.1～1.3:1混合的酶液，充分混勻后，在30～37℃水浴中反應(yīng)12～48小時，得反應(yīng)液，該反應(yīng)液命名為尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)反應(yīng)液；

(5)將步驟(1)、(2)中制得的0.1M的葡萄糖醛酸溶液、0.1M的腺苷三磷酸(ATP)溶液與0.1M的尿苷三磷酸(UTP)溶液按1:1～3:1～2的體積比混合，30±1℃水浴中孵育10±2分鐘，再加入孵育時混合液體積40～60％的步驟(3)中制得的50mg/mL葡萄糖醛酸激酶溶液與50mg/mL葡萄糖醛酸尿苷轉(zhuǎn)移酶溶液按體積比1.1～1.5:1混合的酶液，充分混勻后，在30～37℃水浴中反應(yīng)12～48小時，得反應(yīng)液，該反應(yīng)液命名為尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)反應(yīng)液；

(6)將尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)反應(yīng)液與尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)反應(yīng)液按體積比1:0.8～1.2混合，再加入該混合液體積40～100％的步驟(3)制得的50mg/mL透明質(zhì)酸合酶溶液，充分混勻后，在28～35℃水浴中反應(yīng)24～48小時，100℃煮沸5～10分鐘，得反應(yīng)液，該反應(yīng)液命名為透明質(zhì)酸反應(yīng)液；

(7)將步驟(6)制得的透明質(zhì)酸反應(yīng)液在2～8℃條件下8,000～13,000轉(zhuǎn)/分鐘離心20～60分鐘，收集上清液；

(8)將步驟(7)制得的上清液在30～40℃的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30～60分鐘，去除多余的水分，得含透明質(zhì)酸的濃縮液；

(9)選擇截留分子量為100～1,000的透析袋，以去離子水作為透析液，對步驟(8)制得的濃縮液實施透析去除小分子雜質(zhì)，每間隔6-8小時更換一次透析水，透析3～5次，對透析后溶液冷凍干燥，即獲得透明質(zhì)酸產(chǎn)品。

2.如權(quán)利要求1所述單糖起始的多酶偶聯(lián)合成透明質(zhì)酸的方法，其特征在于，步驟(1)、(2)、(3)中所述的磷酸鹽緩沖液是濃度為0.05M、pH值為7.5的磷酸鈉緩沖液。

3.如權(quán)利要求1所述單糖起始的多酶偶聯(lián)合成透明質(zhì)酸的方法，其特征在于，步驟(4)所述將步驟(1)、(2)中制得的0.1M的N-乙酰氨基葡萄糖溶液、0.1M的腺苷三磷酸(ATP)溶液與0.1M的尿苷三磷酸(UTP)溶液按體積比1:1.2:1.2混合，30±1℃水浴中孵育10±2分鐘，再加入孵育時混合液體積35～65％的步驟(3)中制得的50mg/mL?N-乙酰氨基葡萄糖激酶溶液與50mg/mL?N-乙酰氨基葡萄尿苷轉(zhuǎn)移酶溶液按體積比1.2:1混合的酶液，充分混勻后，在37℃水浴中反應(yīng)16小時，得反應(yīng)液。

4.如權(quán)利要求1所述單糖起始的多酶偶聯(lián)合成透明質(zhì)酸的方法，其特征在于，步驟(5)所述將步驟(1)、(2)中制得的0.1M的葡萄糖醛酸溶液、0.1M的腺苷三磷酸(ATP)溶液與0.1M的尿苷三磷酸(UTP)溶液按1:1.5:1.5的體積比混合，30±1℃水浴中孵育10±2分鐘，再加入孵育時混合液體積40～60％的步驟(3)中制得的50mg/mL葡萄糖醛酸激酶溶液與50mg/mL葡萄糖醛酸尿苷轉(zhuǎn)移酶溶液按體積比1.3:1混合的酶液，充分混勻后，在37℃水浴中反應(yīng)24小時，得反應(yīng)液。