[發明專利]一種基因編碼的環腺苷酸熒光探針及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201410648446.5
• 申請日: 2014-11-14
• 公開（公告）號: CN105646716A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發明（設計）人: 楊弋;張茜;徐磊
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12Q1/02;G01N21/64
• 代理公司: 上海三和萬國知識產權代理事務所(普通合伙) 31230
• 代理人: 章鳴玉

1.一種基因編碼的cAMP熒光探針，其特征在于，其內含有熒光蛋白序列或其衍生物 和對cAMP敏感的多肽，其中所述對cAMP敏感的多肽，

(1)具有cAMP結合特性的CNBD結構域；和/或

(2)來源于對cAMP敏感的被cAMP直接活化調節的鳥嘌呤核苷酸交換因子Epac家族 蛋白。

2.根據權利要求1所述基因編碼的cAMP熒光探針，其特征在于，所述對cAMP敏感的 多肽為來自于真核生物的交換因子Epac蛋白基因的多肽，該多肽的序列選自SEQIDNO： 1、2、3和4。

3.根據權利要求1所述基因編碼的cAMP熒光探針，其特征在于，所述熒光蛋白序列 為環狀排列的黃色熒光蛋白cpYFP如SEQIDNO：21所示。

4.根據權利要求1-3任一項所述基因編碼的cAMP熒光探針，其特征在于，所述熒光 探針所包含的熒光蛋白序列B和對cAMP敏感的多肽中具有cAMP結合特性的CNBD結構域A， 所述B為序列表所示B1和/或B2氨基酸序列，所述A為序列表所示A1和/或A2氨基酸序 列；所述熒光探針的組合形式是：

(1)A-B-A，其中B插入A的柔性區域內，將A分割成A的第一部分和A的第二部分， A的第一部分和A的第二部分共同構成完整的A結構域；

(2)A1-B-A2，其中A1和A2分別串聯在B兩端，A1和A2前后順序可變換；A1是來 自于人體或小鼠組織器官的交換蛋白或其衍生物的氨基酸序列，A2是來自于人體或小鼠組 織器官的另一交換蛋白或其衍生物的氨基酸序列；

所述的cAMP熒光探針優選SEQIDNO：5、6、7、8、39、40、41、42、67所示的蛋白 序列。

5.根據權利要求1所述基因編碼的cAMP熒光探針，其特征在于，所述熒光探針為具 有以下結構：

A₁-A₂-LK₁-FP-LK₂-A₃-A₄，

其中，A₁是Epac蛋白的第一結構域，為SEQIDNO:13或SEQIDNO:14；

A₂是Epac蛋白的第二結構域，為SEQIDNO:15或SEQIDNO:16；

A₃是Epac蛋白的第三結構域，為SEQIDNO:17或SEQIDNO:18；

A₄是Epac蛋白的第四結構域，為SEQIDNO:19或SEQIDNO:20；

FP是熒光蛋白，選自GFP，YFP，CFP以及基于這些蛋白的變異體，優選YFP，更優選cpYFP 如SEQIDNO:21所示；

LK₁可以存在或不存在，存在時，LK₁為T、A、S、G中一種或一種以上氨基酸；

LK₂可以存在或不存在，存在時，LK₂為G、S、T中一種或一種以上氨基酸。

6.根據權利要求1所述基因編碼的cAMP熒光探針，其特征在于，所述cAMP熒光探針 為對熒光蛋白序列和對cAMP敏感的多肽的連接處氨基酸肽段YNSD和LEYN進行截短的突變 體，優選的是SEQIDNO:51-66和SEQIDNO:68-83所示的氨基酸序列。

7.根據權利要求1所述基因編碼的cAMP熒光探針，其特征在于，所述cAMP熒光探針 為對cAMP熒光探針進行定點突變的突變體，所述突變為在Epac2B-CNBD氨基酸序列的93 位、105位、122位、123位、132位、133位、152位、156位、160位、412位上突變； 優選的是SEQIDNO:110-126所示的氨基酸序列。

8.一種編碼權利要求1所述熒光探針的核苷酸序列，包括編碼對cAMP敏感的蛋白質 的核苷酸序列和編碼熒光蛋白的核苷酸序列。

9.根據權利要求8所述的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列選自核苷酸序列SEQ IDNO：9、10、11或12。