[發明專利]體外用細胞代謝輪廓篩選馬兜鈴酸致腎毒性標志物的方法

在審

• 申請號: 201410648382.9
• 申請日: 2014-11-14
• 公開（公告）號: CN105651868A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發明（設計）人: 肖紅斌;劉曉燕;程孟春;王莉
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

技術領域

本發明涉及分析化學和醫藥化學領域，還涉及代謝組學，特別是 基于液相色譜質譜聯用技術的代謝組學；具體的說是一種在體外利用 細胞代謝輪廓篩選馬兜鈴酸致腎毒性標志物的方法。

背景技術

馬兜鈴酸(AA)是存在于馬兜鈴屬植物中的一種重要化學成分， 含有馬兜鈴酸的中藥主要用于治療關節炎、痛風、風濕病以及潰膿創 傷。然而，近10年來，由于服用廣防己(馬兜鈴屬)引起嚴重腎毒 性的案例達100多例。研究表明，馬兜鈴酸是引發腎毒性的主要因素， 其機理主要是馬兜鈴酸與體內的DNA形成加合物，誘導A:T基因的 突變。基因突變勢必會引起下游相關代謝物的變化。目前臨床上還沒 有統一的診斷標準，組織切片，AA-DNA加合物的檢測是通常使用 的診斷方法。開發新的診斷和預測腎損傷程度的標志物勢在必行。

代謝組學作為系統生物學的最下游，能夠更準確的反應生物體 系的狀態。在代謝組學分析的各種手段中，液相色譜質譜聯用技術以 其高分離度、高通量以及普適性的優勢，在眾多分析方法中脫穎而出， 尤其對于非靶向代謝組學分析，其強大的定性分析能力被認為是最好 的復雜生物樣品的分析技術之一。代謝組學在藥物安全性評價，毒性 標志物識別方面具有廣闊的應用前景.研究模型主要是動物模型，例 如，AimingLiu等應用小鼠模型分析了降脂藥二甲苯庚酸誘發肝毒 性的潛在標志物。JingMa應用小型豬模型發現了半乳糖胺誘導急性 肝損傷的生物標志物。然而，應用代謝組學方法研究體外細胞損傷模 型中代謝物差異的報道卻相對較少。

細胞模型與動物模型相比，具有成本低、種屬差異小臨床轉化相 對簡單等優點。申請者應用人源化腎細胞研究了馬兜鈴酸致腎損傷進 展過程中的差異代謝物。由于生物樣品的復雜性，儀器本身存在的不 穩定性及分析序列過長導致質譜響應產生一定的偏差，都會為后續的 數據建模帶來困難。針對以上情況，我們采用總蛋白校正，樣本概率 商歸一化(PQN)及質量控制樣本(QC)校正實驗偏差，以保證實 驗數據的可靠性。

發明內容

本發明的目的在于建立一種基于超高效液相色譜質譜聯用技 術利用體外細胞模型篩選馬兜鈴酸致腎毒性潛在標志物的方法，該方 法具有高靈敏度、高通量的優點。所篩選的潛在標志物預測性好，可 以為中藥致腎毒性的臨床診斷提供參考。

一種從胞內代謝輪廓篩選腎毒性發生發展過程中潛在標志物 的方法，應用代謝組學方法研究體外細胞損傷模型中代謝物差異，

具體步驟如下：

(1)確定馬兜鈴酸致腎細胞明顯損傷的有效劑量；

(2)對正常腎細胞、馬兜鈴酸藥物損傷腎細胞的胞內代謝物進行 分析得到胞內代謝輪廓；

(3)應用多變量統計方法分析正常細胞和馬兜鈴酸藥物損傷細胞 的代謝輪廓數據，結合代謝物隨藥物作用時間的變化規律，篩選標志 物。

步驟(1)使用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑 溴鹽(MTT)染色法確定馬兜鈴酸致腎細胞明顯損傷的有效劑量， 細胞明顯損傷指同等培養條件下馬兜鈴酸誘導損傷實驗組細胞數目 與正常組細胞數目相比，具有顯著性差異，P<0.5，能夠導致這種明 顯損傷的馬兜鈴酸劑量即為馬兜鈴酸致腎細胞明顯損傷的有效劑量， 采用人源化正常腎細胞HL7702作為體外研究馬兜鈴酸致腎毒標志物 的模型，建立了馬兜鈴酸致腎細胞明顯損傷的有效劑量的確定方法：

將懸浮于K-SFM細胞培養基中HK-2細胞等量接種于96孔板中 (104-105個/孔)。過夜貼壁后，去掉原有培養基，實驗組分別加入 150ul-250ul0.3125,0.625,1.25,2.5,5,10,20,40,80μg/ml濃度的馬兜鈴 酸，馬兜鈴酸水溶液采用K-SFM細胞培養基進行稀釋。每個劑量設 計3-6個平行孔，平行設置不加藥，只加等體積培養基的細胞控制組 (對照組)和不接種細胞，只加等體積培養基的空白組。培養24h-48h 后，加入15-20ul含5mg/mlMTT的磷酸緩沖溶液(pH＝7.0)，避光培 養3-5h,棄去培養液，加150ul-200ulDMSO，震蕩300-500s,靜止 10-30s,酶標儀檢測496-570nm波長下的吸光度(OD)。細胞抑制率 按照以下公式計算得出：

抑制率＝(控制組吸光度-給藥組吸光度)/(控制組吸光度-空白組 吸光度)×100％