[發明專利]產醛酮還原酶菌株、醛酮還原酶基因、載體、工程菌及應用

在審

• 申請號: 201410641987.5
• 申請日: 2015-08-03
• 公開（公告）號: CN104498510A
• 公開（公告）日: 2015-07-29
• 發明（設計）人: 鄭裕國;王亞軍;羅希;劉小青
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/02;C12N15/70;C12N1/21;C12N1/19;C12P13/00;C12R1/645
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

(一)技術領域

本發明涉及醛酮還原酶產酶微生物、酶基因和構建這些基因的重組表達載體以及酶醛酮還原酶重組菌，并開發醛酮還原酶重組菌在阿托伐他汀手性側鏈6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯生物催化合成方面的應用。

(二)背景技術

心腦血管疾病已經成為危害人類健康的頭號殺手，預計到2020年，心血管疾病死亡人數將占人類總死亡人數的36％。心腦血管疾病發病與人體內高膽固醇水平有密切關系。阿托伐他汀能競爭性抑制肝臟內膽固醇合成的關鍵限速酶—3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶的活性，降低內源性膽固醇的合成，是治療高膽固醇血癥和混合型高脂血癥的有效藥物，具有起效快、降脂能力強、作用時間長和毒副作用小等優點，是全球首個年銷售額超過百億美元的重磅炸彈藥。

6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯，是阿托伐他汀合成的重要手性中間體，也是關鍵的藥效基團。由于各國藥監部門對藥物手性純度設置嚴苛的限制(e.e.值>99.5％，d.e.值>99％)，6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯的合成技術成為阿托伐他汀合成的關鍵核心技術。傳統的6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯化學合成工藝從酮酸(酯)出發，通過不對稱合成構建手性中心，反應路線復雜，需要使用易燃易爆的硼烷、正丁基鋰等及深冷等特殊條件，導致產物d.e.值低、得率低、能耗大。而且，反應產生的硼化物廢物處理困難，需要經過繁瑣的反復甲醇淬滅、真空蒸餾處理。酶催化反應具有優異的選擇性、反應條件溫和等優點，一般在常溫、常壓及近中性條件下進行，把分解、異構化、外消旋化、重排等不利副反應降到最低限度，生物催化技術具備提高過程原子經濟性、實現過程綠色環境友好?的基本條件。因此，開發生物不對稱還原6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯合成6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯技術，具有巨大的經濟效益和社會效益。

(三)發明內容

本發明目的是提供產立體選擇性醛酮還原酶微生物乳酸克魯維酵母(Kluyvzzzeromyces?lactis)、拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces?bailii)，3條來自K.lactis、Z.bailii的醛酮還原酶基因和含有上述基因的重組載體及其轉化得到的重組菌，開發其在6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯生物催化合成方面的應用。

本發明采用的技術方案是：

本發明提供一種醛酮還原酶基因，所述醛酮還原酶基因的核苷酸序列為SEQ?ID?No.1、SEQ?ID?No.3和SEQ?ID?No.5中的一種。其中SEQ?ID?No.1、SEQ?ID?No.3所示醛酮還原酶基因來自菌株--乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces?lactis)XP1461，保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏日期為2014年8月14日，保藏編號為CCTCC?NO:M?2014380，保藏地址為中國武漢，武漢大學，郵編430072。SEQ?ID?No.5所示醛酮還原酶基因來自菌株--拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces?bailii)XP1462，保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏日期為2014年8月14日，保藏編號為CCTCC?M?2014381，保藏地址為中國武漢，武漢大學，郵編430072。

本發明所述SEQ?ID?No.1、SEQ?ID?No.3所示的醛酮還原酶基因克隆自K.lactis?XP1461(保藏編號CCTCC?M?2014380)，SEQ?ID?No.5所示的醛酮還原酶基因克隆自Z.bailii?XP1462(保藏編號CCTCC?M?2014381)。所述的醛酮還原酶基因可以從K.lactis?XP1461(CCTCC?M?2014380)和Z.bailii?XP1462(CCTCC?M?2014381)基因組中分離獲得，?也可以從該醛酮還原酶基因的重組載體中或者重組表達組中分離獲得，也可以全人工合成獲得。