[發(fā)明專利]一種以乙酸為原料合成間苯三酚的基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用在審
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201410636627.6 | 申請(qǐng)日： | 2014-11-12 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN104371966A | 公開（公告）日： | 2015-02-25 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 咸漠;徐鑫;曹玉錦;張汝兵 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過程研究所 |
| 主分類號(hào)： | C12N1/21 | 分類號(hào)： | C12N1/21;C12N15/70;C12P7/22;C12R1/19 |
| 代理公司： | 北京愛普納杰專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11419 | 代理人： | 張勇 |
| 地址： | 266101 山*** | 國(guó)省代碼： | 山東;37 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 乙酸 原料 合成 間苯三酚 基因工程 及其 構(gòu)建 方法 應(yīng)用 | ||
1.一種以乙酸為原料合成間苯三酚的基因工程菌，其特征在于，是共表達(dá)乙酰輔酶A合成酶基因acs、蘋果酸酶基因maeB、聚烯酮酐合成酶基因phlD和多重抗性因子基因marA的基因工程菌。
2.權(quán)利要求1所述基因工程菌，其特征在于，所述乙酰輔酶A合成酶基因acs和蘋果酸酶基因maeB，來源于枯草芽孢桿菌、煙曲霉菌或大腸桿菌。
3.權(quán)利要求2所述基因工程菌，其特征在于，所述乙酰輔酶A合成酶基因acs，來自大腸桿菌，Gene?ID：12933681；所述蘋果酸酶基因maeB，來自大腸桿菌，Gene?ID：12931931。
4.一種權(quán)利要求1所述基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟如下：
1)獲得聚烯酮酐合成酶基因phlD、多重抗性因子基因marA、乙酰輔酶A合成酶基因acs和蘋果酸酶基因maeB；
2)構(gòu)建含有聚烯酮酐合成酶基因phlD、多重抗性因子基因marA的重組質(zhì)粒；
3)構(gòu)建含有乙酰輔酶A合成酶基因acs和蘋果酸酶基因maeB的重組質(zhì)粒；
4)將步驟2)和步驟3)所得的重組質(zhì)粒導(dǎo)入到宿主菌中，獲得基因工程菌。
5.權(quán)利要求4所述方法，其特征在于，所述乙酰輔酶A合成酶基因acs和蘋果酸酶基因maeB，來源于枯草芽孢桿菌、煙曲霉菌或大腸桿菌。
6.權(quán)利要求4所述方法，其特征在于，所述乙酰輔酶A合成酶基因acs，來自大腸桿菌，Gene?ID：12933681；所述蘋果酸酶基因maeB，來自大腸桿菌，Gene?ID：12931931。
7.權(quán)利要求4所述方法，其特征在于，具體步驟如下：
1)獲得聚烯酮酐合成酶基因phlD、多重抗性因子基因marA、乙酰輔酶A合成酶基因acs和蘋果酸酶基因maeB；
所述乙酰輔酶A合成酶基因acs，來自大腸桿菌，Gene?ID：12933681；所述蘋果酸酶基因maeB，來自大腸桿菌，Gene?ID：12931931；
2)將步驟1)所得的聚烯酮酐合成酶基因phlD、多重抗性因子基因marA、克隆到質(zhì)粒載體pET30上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-pdlD-marA；
3)將步驟1)中所得的乙酰輔酶A合成酶基因acs和蘋果酸酶基因maeB克隆到質(zhì)粒載體pACYC-Duet上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pACYC-maeB-acs；
4)將步驟2)和步驟3)所得的重組質(zhì)粒導(dǎo)入到大腸桿菌BL21(DE3)中，得到重組大腸桿菌。
8.一種利用權(quán)利要求1所述基因工程菌生產(chǎn)間苯三酚的方法，其特征在于，步驟如下：
1)獲得聚烯酮酐合成酶基因phlD、多重抗性因子基因marA、乙酰輔酶A合成酶基因acs和蘋果酸酶基因maeB；
所述乙酰輔酶A合成酶基因acs，來自大腸桿菌，Gene?ID：12933681；所述蘋果酸酶基因maeB，來自大腸桿菌，Gene?ID：12931931；
2)將步驟1)所得的聚烯酮酐合成酶基因phlD、多重抗性因子基因marA、克隆到質(zhì)粒載體pET30上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-pdlD-marA；
3)將步驟1)中所得的乙酰輔酶A合成酶基因acs和蘋果酸酶基因maeB克隆到質(zhì)粒載體pACYC-Duet上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pACYC-maeB-acs；
4)將步驟2)和步驟3)所得的重組質(zhì)粒導(dǎo)入到大腸桿菌BL21(DE3)中，得到重組大腸桿菌；
5)將步驟4)所得的重組大腸桿菌按體積比1％-5％的接種量接種到乙酸培養(yǎng)基中發(fā)酵生產(chǎn)間苯三酚，發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度為30-37℃、pH?6-8和培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.1-1.0mmol·L-1，培養(yǎng)48小時(shí)。
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