[發(fā)明專利]一種黃酮化合物的微生物羥基化轉(zhuǎn)化方法與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410633262.1
• 申請日: 2014-11-10
• 公開（公告）號: CN104388489B
• 公開（公告）日: 2017-10-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李厚金;王坤騰;藍文健;王來友
• 申請（專利權(quán)）人: 中山大學(xué)
• 主分類號: C12P17/06
• 分類號: C12P17/06;C12R1/885;C12R1/685;C12R1/645;C12R1/47;C12R1/01
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司44102
• 代理人: 陳衛(wèi)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物催化轉(zhuǎn)化及有機合成技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種黃酮化合物的微生物羥基化轉(zhuǎn)化方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

黃酮類化合物是以2-苯基色原酮為母核的一類物質(zhì)，兩個芳環(huán)之間通過三碳鏈相連，具有C6-C3-C6基本母體結(jié)構(gòu)。很多黃酮類化合物具有重要生理活性，如抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抗炎鎮(zhèn)痛、抗疲勞、抗衰老、以及保肝活性，此外還有降壓、降血脂等心血管系統(tǒng)疾病治療活性、以及提高機體免疫力等。黃酮類化合物各環(huán)上的羥基取代位置和數(shù)量對活性強弱的影響很大。為獲得高活性黃酮活性化合物，需對黃酮化合物進行羥基化修飾。然而在目前，傳統(tǒng)的化學(xué)合成方法還難以實現(xiàn)碳氫化合物中非活潑性C-H鍵的直接羥基化反應(yīng)。

采用單一的羥基化酶或者整個微生物細胞進行生物催化加氧是實現(xiàn)選擇性羥基化反應(yīng)的一種有效方式。由于酶的特異性，可在底物某一位點選擇性引入羥基，提高活性成分的溶解度和生物利用度。對黃酮的微生物轉(zhuǎn)化有少量報道，E等利用野生型菌株P(guān)enicillium chermesinum113對黃烷酮進行發(fā)酵培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物4’-羥基黃烷酮和2’,4-二羥基二氫查耳酮(2’,4-dihydroxydihydrochalcone)，而且后者是前者的進一步開環(huán)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。該轉(zhuǎn)化產(chǎn)率低、產(chǎn)物多樣，進程不易于控制。4’-羥基黃酮對人蛋白激酶CK2具有高抑制活性，能作為治療癌癥、病毒感染、炎癥等疾病的蛋白激酶導(dǎo)向藥物。

苯環(huán)芳烴，對生物體有毒性，該類化合物的微生物降解一直是國際研究熱點。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)很多細菌、真菌和放線菌都能依靠其產(chǎn)生的酶，對苯環(huán)芳烴進行轉(zhuǎn)化或降解。很多微生物還能生長在以苯，甲苯等作為唯一碳源和能源的培養(yǎng)基里，微生物對這些結(jié)構(gòu)相對簡單的苯環(huán)芳香族化合物有很強的耐受力，能夠啟動自身的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，來抵抗這些化合物的“毒性”，并實現(xiàn)解毒過程。總體而言，目前有關(guān)苯環(huán)芳烴的微生物降解研究文獻很多，但主要是生物學(xué)家和環(huán)境學(xué)家在開展相關(guān)的研究，且工作集中于微生物的篩選、降解產(chǎn)物和降解途徑的分析、酶以及相關(guān)基因的研究。苯環(huán)芳烴的微生物降解可分為有氧降解和厭氧降解。有氧降解以分子氧作為最終電子受體，而厭氧降解以除氧以外的物質(zhì)，如硝酸鹽、硫酸鹽、二氧化碳或Fe³⁺等作為最終電子受體。常規(guī)培養(yǎng)下的好氧微生物能產(chǎn)生混合功能的氧化酶或雙氧化酶，苯環(huán)化合物首先在氧分子和酶的作用下形成鄰苯二酚或其衍生物的共同代謝中間體，然后再進一步經(jīng)過氧分子及開環(huán)酶的作用形成直鏈的分子，最后再進入三羧酸循環(huán)。例如，苯的降解主要是由雙加氧酶攻擊苯環(huán)，形成鄰苯二酚，鄰苯二酚進一步通過間位或鄰位雙加氧酶的作用而產(chǎn)生粘康酸半醛或粘康酸，之后繼續(xù)降解。甲苯的降解一般是通過加氧酶的作用，在2,3碳位上形成二酚，再由2,3-雙加氧酶或1,2-雙加氧酶將其開環(huán)裂解。也可以先發(fā)生甲基的羥基化、羧基化、再發(fā)生苯環(huán)的羥基化(式1)。在苯環(huán)芳烴的降解過程中，微生物加氧酶，如：單加氧酶、雙加氧酶等處于特異性地高活性狀態(tài)，然而，這一降解過程誘導(dǎo)的高活性酶的應(yīng)用仍未見報道。我們堅信這些酶在生物催化轉(zhuǎn)化、有機合成化學(xué)中具有重要的應(yīng)用前景。

式1 苯和甲苯微生物氧化降解的主要中間體

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明為了解決黃酮化合物常規(guī)羥基化轉(zhuǎn)化方法存在的上述缺陷，提供一種利用微生物降解苯環(huán)芳烴類化合物產(chǎn)生的酶來羥基化轉(zhuǎn)化黃酮化合物的方法。

本發(fā)明的另一個目的是提供利用本發(fā)明所述方法得到的羥基化產(chǎn)物的應(yīng)用。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下方案予以實現(xiàn)的：

一種黃酮化合物的微生物羥基化轉(zhuǎn)化方法，具體為，在微生物的發(fā)酵培養(yǎng)液中加入待轉(zhuǎn)化底物黃酮化合物，同時添加苯環(huán)芳香族化合物，繼續(xù)發(fā)酵得到羥基化轉(zhuǎn)化產(chǎn)物羥基黃酮。

微生物能夠?qū)Ρ健⒓妆交蚨妆降缺江h(huán)芳烴類化合物進行氧化降解，但微生物本身無法對黃酮化合物進行羥基化轉(zhuǎn)化，或者轉(zhuǎn)化產(chǎn)率低且產(chǎn)物多樣。但是，如果同時將苯環(huán)芳烴類化合物和黃酮化合物加入到微生物的發(fā)酵液中，微生物在降解苯環(huán)芳烴類化合物時誘發(fā)產(chǎn)生的高活性羥基化酶可以將黃酮類化合物區(qū)域選擇性羥基化。

微生物在各種氧化酶的作用下能將苯、甲苯、二甲苯等苯環(huán)芳烴類化合物轉(zhuǎn)化降解，本發(fā)明涉及到在此轉(zhuǎn)化降解過程中誘發(fā)的高活性羥基化酶在黃酮類化合物羥基化生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。

優(yōu)選地，所述苯環(huán)芳香族化合物為苯、甲苯、二甲苯。

優(yōu)選地，所述黃酮化合物的添加量為一升發(fā)酵培養(yǎng)液中加入1mg～10g黃酮化合物。