[發明專利]腸道病毒EV71型VP1基因病毒樣顆粒及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201410632671.X
• 申請日: 2014-11-11
• 公開（公告）號: CN104450631A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發明（設計）人: 張惠中;王希;林芳;高萍;董軻
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: C12N7/04
• 分類號: C12N7/04;C12N15/62;C12N15/866;A61K39/125;A61P31/14
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 蔡和平

1.一種腸道病毒EV71型VP1基因病毒樣顆粒，其特征在于，該病毒樣顆粒是將cVP1融合基因克隆到真核表達載體及桿狀病毒轉座載體中得到cVP1融合基因重組轉座載體和cVP1融合基因真核表達載體；將gag基因克隆到桿狀病毒轉座載體中，得到gag基因重組轉座載體；用cVP1融合基因的真核表達載體轉染哺乳動物細胞，檢測其表達后，再用cVP1融合基因重組轉座載體和gag基因重組轉座載體制備cVP1和gag的桿粒，將桿粒轉染TN5昆蟲細胞，經分泌表達制得；

其中，所述cVP1融合基因是以重疊PCR法獲得的SIV?GP41與EV71VP1的融合基因，且cVP1融合基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

2.根據權利要求1所述的一種腸道病毒EV71型VP1基因病毒樣顆粒，其特征在于，所述cVP1融合基因包括GP41的信號肽區域、EV71VP1、GP41的跨膜區和胞內區；其中，GP41的信號肽區域的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；EV71VP1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示；GP41跨膜區的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示；GP41胞內區的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示。

3.根據權利要求1所述的一種腸道病毒EV71型VP1基因病毒樣顆粒，其特征在于，所述真核表達載體為pCAGGs，cVP1融合基因克隆到pCAGGs載體所形成的的重組質粒為cVP1-pCAGGs。

4.根據權利要求1所述的一種腸道病毒EV71型VP1基因病毒樣顆粒，其特征在于，所述的桿狀病毒轉座載體為pFastBac^TM1，cVP1融合基因克隆到pFastBac^TM1所形成的重組轉座載體為cVP1-pFastBac^TM1，gag基因克隆得pFastBac^TM1所形成的重組轉座載體為gag-pFastBac^TM1。

5.一種腸道病毒EV71型VP1基因病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)采用重疊PCR法制得包括GP41的信號肽區域、EV71VP1、GP41的跨膜區和胞內區的cVP1融合基因，將cVP1融合基因克隆入桿狀病毒轉座載體pFastBac^TM1中，得到重組轉座載體cVP1-pFastBac^TM1；

2)采用PCR方法制得gag基因，將gag基因克隆入桿狀病毒轉座載體pFastBac^TM1中，得到重組轉座載體gag-pFastBac^TM1；

3)將重組轉座載體cVP1-pFastBac^TM1和gag-pFastBac^TM1分別轉化DH10Bac感受態細胞，然后與Bacmid進行重組，經鑒定，分別得到重組桿粒gag-Bacmid和cVP1-Bacmid；

4)將重組桿粒gag-Bacmid和cVP1-Bacmid分別轉染TN5昆蟲細胞，直至細胞病變率超過80％后，離心收集上清，得到P1代病毒，將P1代病毒連續傳代2次后，得到重組桿狀病毒rBV?gag和rBV?cVP1；

5)將重組桿狀病毒rBV?cVP1和rBV?gag以(3～10):1的MOI比例接種TN5細胞，經懸浮培養后離心收集上清，經純化制得腸道病毒EV71型VP1基因病毒樣顆粒。

6.根據權利要求5所述的一種腸道病毒EV71型VP1基因病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，步驟1)是將cVP1融合基因克隆入桿狀病毒轉座載體pFastBac^TM1的EcoRI、NotI酶切位點之間，得到重組轉座載體cVP1-pFastBac^TM1；步驟2)是將gag基因克隆入桿狀病毒轉座載體pFastBac^TM1EcoRI、HindIII酶切位點之間，得到重組轉座載體gag-pFastBac^TM1。

7.根據權利要求5所述的一種腸道病毒EV71型VP1基因病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，步驟5)所述的重組桿狀病毒rBV?cVP1和rBV?gag的MOI比例為3:1、6:1或10:1；且是在28℃下懸浮培養72h后離心收集上清。