[發明專利]單核細胞增生李斯特氏菌實時濁度LAMP檢測方法

有效

• 申請號: 201410632370.7
• 申請日: 2014-11-11
• 公開（公告）號: CN104313173A
• 公開（公告）日: 2015-01-28
• 發明（設計）人: 黃朱梁;薛超波;王萍亞
• 申請（專利權）人: 舟山市質量技術監督檢測研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于微生物檢測技術領域，具體涉及一種單核細胞增生李斯特氏菌的實時濁度LAMP快速檢測方法。

背景技術

單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria?monocytogenes)是一類兼性細胞內生長的革蘭陽性細菌，致病力較強，能引起人和動物的李斯特菌病，是重要的食源性人畜共患病原菌。單增李斯特氏菌營養要求不高，環境適應性強，既可在2～4℃下生長，也可在-18℃下存活，甚至在反復凍融的條件下仍可存活。近年來，歐美國家因食用李斯特菌污染的食品的病患呈上升趨勢，世界衛生組織(WHO)已將其列為20世紀90年代以來食品中四大致病菌之一，成為許多國家食品衛生安全的必檢項目。

目前，對單核細胞增生李斯特氏菌的檢測仍以傳統方法為主，不但檢驗周期長(4～7d)、操作繁瑣，且準確性和靈敏性低，不利于食源性疾病的快速檢測。因此，有必要提供一種更有效的檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種單核細胞增生李斯特氏菌的實時濁度LAMP快速檢測方法，從而彌補現有技術的不足。

本發明首先提供一種用于檢測單核細胞增生李斯特氏菌的LAMP引物組，引物信息如下：

LMO-F3：ATCGATCACTCTGGAGGA(SEQ?ID?NO:1)

LMO-B3：AAGCTAAACCAGTGCATTC(SEQ?ID?NO:2)

LMO-FIP(SEQ?ID?NO:3)：

TGAACAATTTCGTTACCTTCAGGATTACGTTGCTCAATTCAACATCT

LMO-BIP(SEQ?ID?NO:4)：

GGAGCGAAAACAATAAAAGTAAGCTGCGTAAACATTAATATTTCTTGCG。

本發明還提供一種利用上述的LAMP引物組檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方法，包括有如下的步驟：

1)待檢測基因組DNA的提取：用細菌基因組DNA提取試劑盒(上海生工)提取細菌DNA；

2)環介導等溫擴增步驟：根據本發明設計的單核細胞增生李斯特氏菌的LAMP引物，加入反應體系中各組分，擴增溫度為62.5℃，實時濁度儀中反應60min，80℃，5min，終止反應；

3)結果檢測：直接通過實時濁度儀觀察或擴增產物經2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

本發明針對單核細胞增生李斯特氏菌的溶血素基因設計一套LAMP引物，利用實時濁度儀對單核細胞增生李斯特氏菌進行檢測，并驗證檢測方法的特異性和靈敏度，從而建立快速、特異、靈敏的單核細胞增生李斯特氏菌LAMP檢測方法。

附圖說明

圖1：LAMP特異性試驗結果圖，其中曲線為單核細胞增生李斯特氏菌擴增曲線，其余11株其他菌株均未出現擴增曲線。

圖2：LAMP靈敏度試驗結果圖，其中1～6為10-1～10-6濃度級稀釋菌液，7為空白對照。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明的方法進行詳細的描述。

一、用于檢測單核細胞增生李斯特氏菌的LAMP引物組的設計

本發明根據GeneBank中公布的單核細胞增生李斯特氏菌hlyA基因，進行序列的保守性分析，從中篩選出溶藻膠弧菌的高度保守序列，用Primer?Explorer?V4.0軟件(http://primer-explorer.jp/e/v4-manual/index.heml)進行引物設計。設計合適的引物是進行LAMP反應的關鍵，通過考慮堿基組成，GC含量，二級結構的形成，Tm值等因素來設計溶藻膠弧菌LAMP反應的引物。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。引物如表1所示：

表1?用于擴增單核細胞增生李斯特氏菌hlyA基因的LAMP引物序列

二、溶藻膠弧菌的LAMP引物的效果檢測

1.1試驗材料

菌株：單核細胞增生李斯特氏菌、擬態弧菌、溶藻弧菌、哈氏弧菌、河流弧菌、霍亂弧菌、擬態弧菌、志賀氏菌、沙門氏菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、創傷弧菌。

1.2細菌DNA提取

將供實驗的菌株分別接種于5mL增菌培養基(單核細胞增生李斯特氏菌用TSB-YE培養液培養，弧菌用堿性蛋白胨水培養，其他菌株用BPW培養)中，按每種細菌的最適溫度培養過夜，取1mL菌液，按照試劑盒說明書提取細菌基因組DNA。提取的基因組DNA于-20℃保存備用。