[發(fā)明專利]蛙皰疹病毒1型的LAMP快速檢測方法及試劑盒

有效

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• 申請日: 2014-11-11
• 公開（公告）號: CN104293983B
• 公開（公告）日: 2017-11-03
• 發(fā)明（設計）人: 王曉龍;汪環(huán)
• 申請（專利權）人: 東北林業(yè)大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 北京國坤專利代理事務所(普通合伙)11491
• 代理人: 姜彥

技術領域

本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)科學生物技術應用領域，具體涉及蛙皰疹病毒1型的LAMP快速檢測方法以及與該方法配套實用的檢測試劑盒。

背景技術

皰疹病毒在哺乳類、鳥類、爬行類等多種動物中均有發(fā)現(xiàn)，并且均可導致嚴重的傳染病。根據(jù)宿主種類的不同，可將皰疹病毒分為三組：感染哺乳類、鳥類和爬行類的；感染兩棲類和硬骨魚類的以及單獨一類可感染無脊椎動物中的雙殼綱動物的。這其中，能感染兩棲動物的兩類分別為蛙皰疹病毒1型(RaHV-1；又稱盧克皰疹病毒)和蛙皰疹病毒2型(RaHV-2；又稱蛙病毒4)。

蛙皰疹病毒1型首次發(fā)現(xiàn)于南美豹蛙(Rana pipiens)的一種腎腺癌(即盧克腫瘤)組織中，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)該病毒即為這種腎腺癌的病原體，蛙皰疹病毒1型具有非常獨特的溫度依賴機制：低溫條件會促進其進行復制，但會抑制其轉(zhuǎn)移和擴散。蛙皰疹病毒1型的DNA大小約為220kbp左右，經(jīng)序列比對后證明其與海水鯰魚皰疹病毒(Ictalurid herpesvirus 1,IcHV-1)親緣關系較為相近。由于盧克腫瘤在野生豹蛙中的發(fā)生頻率非常高，對野生豹蛙的種群數(shù)量產(chǎn)生了非常嚴重的危害，因此，進一步研究蛙皰疹病毒的生物學特性并開發(fā)出簡便、快速的檢測手段對于保護和避免野生蛙類受到該病害威脅具有重要作用。

發(fā)明內(nèi)容

環(huán)介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種新型核酸擴增技術，由日本學者Notomi等發(fā)明的一種新型的基因擴增技術，相較于傳統(tǒng)的PCR技術，具有操作簡便，特異性強，結(jié)果易觀察等特點。

本發(fā)明利用LAMP技術，首次開發(fā)出針對蛙皰疹病毒的LAMP快速檢測方法，對及時發(fā)現(xiàn)和診斷出蛙的盧克腫瘤具有重要意義。

本發(fā)明的目的在于公開了蛙皰疹病毒1型的LAMP快速檢測方法。

本發(fā)明的第二個目的在于公開了用于蛙皰疹病毒1型LAMP快速檢測方法的試劑盒。

本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的：

蛙皰疹病毒1型的LAMP快速檢測方法，包括下述步驟：

(1)、提取待測樣本總DNA作為反應模板；

(2)、配置LAMP反應溶液，其中LAMP反應溶液由Bst DNA聚合酶、水霉菌、滅菌水、2×反應緩沖液和引物混合物組成，體積比為：

Bst DNA聚合酶:水霉菌:滅菌水:2×反應緩沖液:引物混合物＝1:2:8.6:12.5:0.9；

(3)、將步驟(1)提取的樣本總DNA加入到步驟(2)配制的LAMP反應溶液中，混合；

(4)、在60℃恒溫水浴中反應30分鐘；

(5)、診斷結(jié)果：將步驟(4)擴增反應后產(chǎn)物用電泳檢測或熒光染料技術進行鑒定，呈陽性的表示樣本含有蛙皰疹病毒1型，呈陰性的表示樣本不含有蛙皰疹病毒1型。

上述技術方案所述的蛙皰疹病毒1型LAMP快速檢測方法，其中，步驟(2)中的2×反應緩沖液由900μL 2×LAMP反應緩沖液和100μL濃度為25mM的dNTP混合液組成；其中2×LAMP反應緩沖液的組成為：1M pH8.8Tris-HCl 40mL，KCl 1.49g，MgSO₄1.93g，(NH4)₂SO₄2.64g，Tween202mL和Betaine 187.4g；其中100μL的dNTP混合液由25μLdATP、25μL dCTP、25μL dGTP和25μL dTTP組成；

所述引物混合物由20μL FIP、20μL BIP、2.5μL F3和2.5μL B3組成，其中FIP、BIP、F3和B3的濃度均為100μM；外引物F3序列如SEQ No.2所示，外引物B3序列如SEQNo.3所示，內(nèi)引物FIP序列如SEQ No.4所示和內(nèi)引物BIP序列如SEQ No.5所示。

上述技術方案所述的蛙皰疹病毒1型LAMP快速檢測方法，其中，步驟(3)中樣本總DNA與LAMP反應溶液之間的體積比為1:25。

上述技術方案所述的蛙皰疹病毒1型LAMP快速檢測方法，其中，步驟(5)中電泳檢測的過程為：取產(chǎn)物5μL進行2.0％瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為120V，20min；電泳圖出現(xiàn)條帶的為陽性，沒有出現(xiàn)條帶的為陰性。