[發(fā)明專利]一種用于熒光定量PCR反應(yīng)的熒光探針

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201410631409.3
• 申請日: 2014-11-11
• 公開（公告）號: CN104404142A
• 公開（公告）日: 2015-03-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 景奉香;李剛;張冀申;賈春平;金慶輝;趙建龍
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 潘振甦

1.一種用于熒光定量PCR反應(yīng)的熒光探針，其特征在于所述的探針包含一條寡核苷酸序列，其5’端為擴(kuò)增靶序列特異性寡核苷酸序列，并在5’端修飾熒光基團(tuán)，3’端為一段與5’序列反向互補(bǔ)回文結(jié)構(gòu)核苷酸序列，并修飾熒光淬滅基團(tuán)，在一定條件下，該探針形成分子內(nèi)二級結(jié)構(gòu)，熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)靠近從而淬滅熒光基團(tuán)釋放出熒光信號；

所述的探針，命名為TLoop；

所述的一定條件，指PCR反應(yīng)或雜交反應(yīng)過程中所需要的緩沖條件、離子強(qiáng)度和表面活性劑濃度。

2.按權(quán)利要求1所述的探針，其特征在于在PCR反應(yīng)復(fù)性溫度條件下，5’端序列優(yōu)先與靶序列結(jié)合，5’端熒光報(bào)告基團(tuán)在Taq?DNA聚合酶的5’端外切酶作用下斷裂下來，并釋放出熒光信號。

3.按權(quán)利要求1所述的探針，其特征在于所述的探針使用的核苷酸為DNA、RNA或輔以適當(dāng)?shù)腖NA修飾，但5’端第一堿基修飾熒光基團(tuán)是被TaqDNA聚合酶的5’外切酶剪切。

4.按權(quán)利要求1所述的探針，其特征在于5’端靶序列互補(bǔ)片段Tm值高于PCR復(fù)性溫度2-10℃；3’端反向互補(bǔ)回文結(jié)構(gòu)序列根據(jù)5’端序列的Gc含量的不同，設(shè)計(jì)為5-12個(gè)核苷。

5.按權(quán)利要求1所述的探針，其特征在于形成的分子內(nèi)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，5’端序列突出0-5個(gè)堿基。

6.按權(quán)利要求1或5所述的探針，其特征在于5’端序列突出3-5個(gè)堿基。

7.按權(quán)利要求1或4所述的探針，其特征在于3’端反向互補(bǔ)回文結(jié)構(gòu)序列為7-9個(gè)堿基。

8.按權(quán)利要求1所述的探針，其特征在于：

①針對修飾熒光，所有存在熒光共振轉(zhuǎn)移作用的熒光基團(tuán)-淬滅基團(tuán)對都可以用在探針修飾上，所用的熒光基團(tuán)是FAM、TET、HEX、VIC、5-TAMRA、ROX、Texas?Red-X、cy3、cy5或JOE；熒光淬滅基團(tuán)最常用的比如BHQ系列，Dabcyl或Eclipse；

②在熒光定量PCR反應(yīng)過程中，存在PCR反應(yīng)的變性、復(fù)性和延伸三個(gè)溫度階段，在變性階段時(shí)，探針頸環(huán)結(jié)構(gòu)解離，復(fù)性階段中，當(dāng)體系中含有匹配模板時(shí)，探針環(huán)狀結(jié)構(gòu)區(qū)域與模板結(jié)合，使探針的頸環(huán)結(jié)構(gòu)無法恢復(fù)，探針5’端與模板完全結(jié)合，在PCR延伸過程中，Taq?DNA聚合酶通過5’外切酶的作用剪切探針，探針5’端熒光素從探針上解離，徹底釋放出熒光信號；若體系中不含目標(biāo)DNA，復(fù)性過程中探針無法與模板結(jié)合，探針傾向于頸環(huán)結(jié)構(gòu)恢復(fù)，熒光信號被淬滅；經(jīng)過多個(gè)循環(huán)以后，被剪切下來的熒光素逐步累積，從而達(dá)到檢測靶DNA的作用。

9.權(quán)利要求1所述的探針的應(yīng)用，其特征在于用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測和數(shù)字PCR技術(shù)檢測；用作實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測時(shí)，復(fù)性溫度檢測熒光信號，為使探針維持頸環(huán)結(jié)構(gòu)，在延長莖干區(qū)域的長度，或者在莖干區(qū)域添加LNA核苷，以提高莖干雙鏈區(qū)域的Tm值；用于數(shù)字PCR平臺終點(diǎn)檢測方法時(shí)，對探針莖干區(qū)域的Tm值只要求5-10個(gè)堿基。

10.按權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于具體步驟是：

A：基于TLoop探針的熒光定量PCR技術(shù)檢測EGFR基因L858Q突變

1、探針及引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)人EGFR基因第21外顯子L858Q基因突變類型設(shè)計(jì)引物和探針，上游引物E21F序列為5’-cgcagcatgtcaagatca-3’，下游引物E21R序列為5’-cctccttactttgcctcc-3’，PCR產(chǎn)物長度92bp；TLoop探針TL858序列為5’-FAM--BHQ1-3’；TaqMan探針TM858序列為5’-FAM--BHQ1-3’；其中，探針框起來的堿基為突變位點(diǎn)，灰色陰影部分為莖干結(jié)構(gòu)區(qū)域；

然后將上述引物及探針設(shè)計(jì)好后送英濰捷基公司合成，合成產(chǎn)物用無菌去離子水稀釋至終濃度100μM儲存，使用時(shí)稀釋10倍；

2、熒光定量PCR體系的配制

將探針和引物用無菌去離子水稀釋到終濃度10μM，各PCR組分按以下配方配制，DNA模板為包含EGFR?L858Q基因突變的人工質(zhì)粒，純化、定量后用TE緩沖液稀釋到終濃度分別為10⁵copies/μL、10⁴copies/μL、10³copies/μL、10²copies/μL、10¹copies/μL，同時(shí)用不含核酸的TE緩沖液作為陰性對照；

3、PCR反應(yīng)及數(shù)據(jù)分析

反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10min，隨后94℃15s，58℃20s，檢測FAM熒光信號，共50個(gè)循環(huán)；

與一般的TaqMan探針相比，擴(kuò)增曲線很好，檢測靈敏度可以達(dá)到10個(gè)拷貝的核酸，靈敏度高，陰性對照沒有起峰，說明探針的特異性優(yōu)于一般的TaqMan探針；

B：基于頸環(huán)探針的數(shù)字PCR技術(shù)檢測EGFR基因L858Q突變

1、芯片制作

通過模塑法制作PDMS芯片，首先將PDMS預(yù)聚體與固化劑按照質(zhì)量比10：1混合，抽真空除氣，澆注在預(yù)先制備好的硅片模具上，另外在載玻片上薄涂一層相同的PDMS，靜置1h，放于65℃熱板上預(yù)固化30分鐘，將澆注于模具上的PDMS剝離，打孔，將有管道面與涂層后的玻璃涂層面貼合在一起，并在進(jìn)樣槽上方加蓋一蓋玻片；最后將貼合好的PDMS放入85℃的熱板上加熱10min，使其鍵合；

2、探針及引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)人EGFR基因第21外顯子L858Q基因突變類型設(shè)計(jì)引物和探針，上游引物E21F序列為5’-cgcagcatgtcaagatca-3’，下游引物E21R序列為5’-cctccttactttgcctcc-3’，PCR產(chǎn)物長度92bp；TLoop探針TL858序列為5’-FAM--BHQ1-3’，TaqMan探針TM858序列為5’-FAM--BHQ1-3’，其中，探針框起來的堿基為突變位點(diǎn)，灰色陰影部分為莖干結(jié)構(gòu)區(qū)域；

然后將上述引物及探針設(shè)計(jì)好后送英濰捷基公司合成，合成產(chǎn)物用無菌去離子水稀釋至終濃度100μM儲存，使用時(shí)稀釋10倍；

3、熒光定量PCR體系的配制

將探針和引物用無菌去離子水稀釋到終濃度10μM，各PCR組分按以下配方配制。DNA模板為包含EGFR?L858Q基因突變的人工質(zhì)粒，濃度10³copies/μL；

4、進(jìn)樣

首先制備PCR預(yù)混液，在樣品進(jìn)樣口注入PCR預(yù)混液，油進(jìn)樣口注入含乳化劑的含3％Abil?EM90液體石蠟，將注射器置于泵上，利用負(fù)壓泵的抽吸作用，PCR預(yù)混液及石蠟油由進(jìn)樣口朝出樣口方向流動(dòng)，在芯片十字交叉結(jié)構(gòu)處PCR預(yù)混液在兩側(cè)石蠟油的夾流作用下切割形成納升級的乳滴聚集在芯片的乳滴收集區(qū)，進(jìn)樣結(jié)束后用PDMS封閉進(jìn)樣及出樣口；

5、PCR反應(yīng)及數(shù)據(jù)分析

將該芯片即可放入PCR儀進(jìn)行在片的原位PCR擴(kuò)增，PCR循環(huán)程序?yàn)椋?5℃10min預(yù)變性，95℃10s，58℃40s循環(huán)，共35個(gè)循環(huán)，最后采用熒光顯微鏡觀察結(jié)果，CCD照相，計(jì)數(shù)熒光信號陽性乳滴。