[發明專利]一種新型毛葉茶無色花青素還原酶LAR2及其編碼基因

在審

• 申請號: 201410628470.2
• 申請日: 2014-11-11
• 公開（公告）號: CN104357411A
• 公開（公告）日: 2015-02-18
• 發明（設計）人: 李密密;溫堯林;杭悅宇;渠艷秋
• 申請（專利權）人: 江蘇省中國科學院植物研究所;江蘇凱吉生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/11;A01H5/00
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• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及分子生物學和基因工程領域中毛葉茶（Camellia?ptilophylla）無色花青素還原酶（leucoanthocyanidin?reductase,?LAR2）、其編碼基因、包含該基因的重組表達載體及其轉化體。

背景技術

毛葉茶(Camellia?ptilophylla?Chang)是中山大學張宏達教授于80年代在廣東境內發現的一種天然無咖啡堿茶種質資源，又稱可可茶。它與傳統茶（C.?sinensis?(L.)?O.?Ktze.?&?C.?assamica?var.?kucha?Chang?et?Wang）的主要兒茶素成分呈現手性對稱：傳統茶以順式的表兒茶素為主，即表沒食子兒茶素沒食子酸酯[(-)-epigallocatechin-3-gallate,?EGCG]、表沒食子兒茶素[(-)-epigallocatechin,EGC]、表兒茶素沒食子酸酯[(-)-epicatechin?-3?-gallate,?ECG]、表兒茶素[(-)-epicatechin,?EC]等；而毛葉茶以反式的兒茶素為主，即沒食子兒茶素沒食子酸酯[(+)-gallocatechin-3-gallate,?GCG]、沒食子兒茶素[(+)-gallocatechin,?GC]，[(+)-catechin-3-gallate,?CG]、兒茶素[(+)-catechin,?C]等。

兒茶素是茶葉中重要的多酚類次生代謝產物，是茶葉苦和澀的味道的主要來源，同時影響茶葉香氣物質的表現，研究表明兒茶素具有重要的保健功能。目前，順式兒茶素EGCG是茶葉中公認的的抗氧化成分，然而現有研究已經證實，反式兒茶素在抗過敏、對環氧酶和酪氨酸酶等許多酶的抑制作用、清除自由基活性等方面的生理活性要強于順式兒茶素EGCG，并被發現具有獨特的美白、抗良性前列腺增生、抗病毒、抑制膽固醇吸收、抑制破骨細胞形成等活性。

兒茶素合成途徑中，無色花青素還原酶(leucoanthocyanidin?reductase,?LAR)催化無色花青素轉變為反式兒茶素C和GC。通過對毛葉茶轉錄組數據的分析，我們發現毛葉茶除了無色花青素還原酶LAR1與茶的LAR高度同源外，還存在另外一種新型的無色花青素還原酶LAR2，因此本發明通過對毛葉茶LAR2基因的克隆，構建重組表達載體，進行原核表達，最終獲得目的表達蛋白，這將為成功揭示反式兒茶素的合成機制提供有力證據。

發明內容

本發明的毛葉茶LAR2基因由1197個堿基組成，含有一個完整的開放閱讀框，開放閱讀框的起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA，為序列表中的SEQ.ID.NO:1序列，將此基因命名為CpLAR2。

本發明的毛葉茶LAR2蛋白由399個氨基酸組成，為序列表中的SEQ.ID.NO:2序列，毛葉茶LAR2蛋白的理論分子量為43.4Da，等電點為5.25。

????含有上述SEQ.ID.NO:1序列及其開放閱讀框架的多核苷酸的載體，以及用上述SEQ.ID.NO:1序列及其開放閱讀框架的多核苷酸轉化的生物細胞，均是本發明需要保護的內容。

????本發明基因的發現，使通過基因調控來控制反式兒茶素合成成為可能，對于培育反式兒茶素為主的茶種質資源具有重要意義。

????下面結合具體實施例對本發明作進一步說明。

附圖說明：

圖1為毛葉茶嫩葉總RNA

圖2為CpLAR2基因全長PCR擴增產物

圖3為不同植物無色花青素還原酶序列比對圖

圖4為原核表達載體pET-28a-CpLAR2的構建流程圖

圖5為載體pET-28a-CpLAR2的酶切圖譜

圖6為大腸桿菌中CpLAR2表達產物的Western?Blot分析

具體實施方式

以下實施例、實驗例僅對本發明進行進一步的說明，不應構成對本發明的進一步的限制。

實施例1、CpLAR2基因的克隆

克隆CpLAR2，具體步驟如下:

毛葉茶產自廣東省惠州市象頭山，移植于江蘇省中科院植物研究所種植圃，成活后，與生長旺盛期采集鮮葉葉片，液氮速凍后用于總RNA的提取，總RNA經過反轉錄合成cDNA，cDNA進行特異引物PCR反應，最終獲得CpLAR2基因。

1、毛葉茶總RNA的提取和cDNA反轉錄