[發明專利]一種雜交指示劑5,7-二硝基-2-磺基-吖啶酮的制備方法和用途

有效

• 申請號: 201410628402.6
• 申請日: 2014-11-11
• 公開（公告）號: CN104316705A
• 公開（公告）日: 2015-01-28
• 發明（設計）人: 陳敬華;李春艷;趙燕蘋;劉智晶;吳冬枝;陳梅;章溪;劉映昕
• 申請（專利權）人: 福建醫科大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N27/327;G01N27/26
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

1.一種雜交指示劑5,7-二硝基-2-磺基-吖啶酮，其特征在于：所述5,7-二硝基-2-磺基-吖啶酮結構式為????????????????????????????????????????????????。

2.一種如權利要求1所述的一種雜交指示劑5,7-二硝基-2-磺基-吖啶酮的制備方法，其特征在于：所述步驟為：稱取0.6?g?吖啶酮，加入5?mL濃H₂SO₄，攪拌溶解后，加熱至100℃反應30?min，趁熱將溶液倒入0~4℃冰水中，固體析出，過濾干燥得到淺綠色固體2-磺基-吖啶酮；稱取0.6?g?2-磺基-吖啶酮，加入3?mL?36?%乙酸，再依次加入0.36?mL的濃硝酸和0.8?mL的冰醋酸，于56~60?℃下攪拌反應2?h，趁熱將溶液倒入冰水中，固體析出，過濾，用10~20?mL水沖洗，并用無水乙醇進一步重結晶純化，得到黃色針狀粉末5,7-二硝基-2-磺基-吖啶酮。

3.一種如權利要求1所述的一種雜交指示劑5,7-二硝基-2-磺基-吖啶酮在電化學傳感器上的應用。

4.根據權利要求3所述的一種雜交指示劑5,7-二硝基-2-磺基-吖啶酮在電化學傳感器上的應用，其特征在于：所述的電化學傳感器制備方法包括：

1）電極的預處理

將玻碳電極在0.05?μm的Al₂O₃粉上打磨，并先后用無水乙醇和雙蒸水超聲震蕩5?min，以除去附在電極表面上的雜質，用10?mM?鐵氰化鉀表征電極表面，直至前后峰位電壓差值小于80?V，蒸餾水洗凈擦干后取出，氮氣吹干；

2）探針修飾電極的制備

將處理后的玻碳電極置于含0.01?M/L?賴氨酸的pH?8.0、0.2?M?PBS?緩沖液中，用循環伏安法電合修飾聚賴氨酸膜，再用雙蒸水徹底沖洗電極并在室溫下干燥，得到聚賴氨酸修飾電極，將聚賴氨酸修飾電極倒置，表面滴加20?μL偶聯活化劑，室溫自然蒸干，然后用超純水清洗10?s，除掉未結合在修飾電極表面的偶聯活化劑，氮氣吹干待用；然后在電極表面滴加10?μL?1μM發卡結構的探針基因P溶液，室溫自然蒸干，用超純水清洗除掉未結合在電極表面的探針基因P，再用10?mM?pH7.0?PBS緩沖液清洗，室溫干燥，制得發卡探針修飾電極；

3）酶輔助靶序列循環

將發卡探針修飾電極置于一系列濃度的靶序列c-erbB-2相關基因溶液中，室溫下雜交1?h后清洗吹干，將雜交后的電極置于10?U?核酸外切酶III的緩沖液中，37?℃下反應30?min后，清洗吹干待用；

4）DNA長距式自組裝及電化學檢測

分別取10?μL?1μM的輔助探針基因AP1和AP2溶液滴涂在上述電極表面，室溫下進行DNA長距式自組裝，2?h后清洗吹干；分別在含有質量比例為1:1的5?mM?K₃[Fe?(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆]的100?mM?pH?7.0?PBS?+?0.1?M?KCl緩沖溶液測量不同修飾電極的CV曲線，掃描速率為0.05?V/s，采樣間隔為0.001?V，靜置時間為2?s；將DNA長距式自組裝后的電極置于含100?μM?5,7-二硝基-2-磺基-吖啶酮的10?mM?pH?7.0?PBS緩沖溶液中，20?min后清洗吹干；而后將電極置于100?mM?pH?5.0?磷酸鹽PB緩沖溶液中掃描CV和方波伏安法曲線。

5.根據權利要求4所述的一種雜交指示劑5,7-二硝基-2-磺基-吖啶酮在電化學傳感器上的應用，其特征在于：所述循環伏安法的條件為：電壓-1.0?~?+2.4?V，掃描速率為100?mVs-1，表征圈數為14圈。

6.根據權利要求4所述的一種雜交指示劑5,7-二硝基-2-磺基-吖啶酮在電化學傳感器上的應用，其特征在于：所述偶聯活化劑為含5?mM?的EDC和8?mM的NHS的pH?7.4磷酸緩沖液。

7.根據權利要求4所述的一種雜交指示劑5,7-二硝基-2-磺基-吖啶酮在電化學傳感器上的應用，其特征在于：所述CV法的掃描速率為0.50?V/s，采樣間隔為0.001?V，靜置時間為2?s；方波伏安法的掃描電位范圍為-0.2?V?~?+0.15?V，電位增量為0.005?V，幅度為0.025?V。

8.根據權利要求4所述的一種雜交指示劑5,7-二硝基-2-磺基-吖啶酮在電化學傳感器上的應用，其特征在于：所述探針P序列為5'-NH2-AAA?AAT?TTA?TTT?GAT?AGG?CGA?ACT?ATT?TGT?TTT?TAA?TAT?CAA?ATA?ATG?GTT-3'；所述探針AP1序列為5'-CAA?AAT?ATA?T?GA?TAG?GCG?AA-3'；探針AP2序列為5'-ATA?TAT?TTT?GTT?CGC?CTA?TC-3'。