[發明專利]分泌抗柑橘衰退病毒單抗雜交瘤細胞株及其單抗應用

有效

• 申請號: 201410626880.3
• 申請日: 2014-11-10
• 公開（公告）號: CN104403999A
• 公開（公告）日: 2015-03-11
• 發明（設計）人: 吳建祥;洪健;陳浙;周雪平;劉震;劉金香;周常勇
• 申請（專利權）人: 浙江大學;中國農業科學院柑桔研究所
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/10;G01N33/577;G01N33/569;C12R1/91
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 張法高

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種分泌抗柑橘衰退病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其單抗的應用。

背景技術

柑橘衰退病毒(Citrus?tristeza?virus?,?CTV)?廣泛分布于世界各柑橘產區,?其引起的衰退病是最具危害性的柑橘病害之一,?該病毒主要通過蚜蟲和帶毒接穗傳播。CTV?存在明顯的株系分化現象,?除少數株系在某些柑橘品種上不產生可見癥狀外,?大部分株系能在柑橘上產生明顯癥狀,?常見癥狀可分為三大類型,?即速衰型、莖陷點型和苗黃型。速衰型癥狀主要表現在以酸橙作砧木的甜橙等感病柑橘上;?莖陷點癥狀的發生與砧木種類無關,?常導致葡萄柚或甜橙產量降低、品質下降、植株矮化;?苗黃癥狀在田間很少發生,?主要是在酸橙、來檬或葡萄柚的苗期引起嚴重褪綠和矮化。CTV?為長線形病毒科(Closteroviridae)?長線形病毒屬(?Closterovirus?)成員,?病毒粒子細長彎曲,?大小約2?000nm?×?(10～12)?nm?,?其基因組全長約為2?×104?個核苷酸,?是已知植物病毒中基因組最大的病毒。CTV具有2?種外殼蛋白,?其中主要外殼蛋白(CP)?分子量為25?kD?,?包裹了病毒粒子長度的95?%;?次要外殼蛋白(dCP)?分子量為27kD?,?包裝在病毒粒子的尾部。針對CTV?引起的柑橘衰退病,?各國普遍采取的防治措施是使用無病毒的種苗和采用抗病或耐病砧木。而在美國和巴西等國利用弱毒株系對強毒株系的交叉保護作用對該病取得了很好的控制效果。病毒的檢測是無病毒種質培育和弱毒株系篩選過程中的一個重要環節,?目前,?美國、西班牙、日本和意大利等國均已研制出針對該國特定CTV?株系的血清學檢測試劑盒。我國對CTV?的研究始于20?世紀50～60?年代,?大量的研究表明該病毒的多種株系在我國有廣泛的分布,?傳毒性強的介體褐色橘蚜(?Toxoptera?citricida?Kirkaldy)?也廣泛存在,?隨著我國柑橘品種結構的調整,?強毒株系的危害變得日益嚴重。近些年來,?柑橘無病毒種質的培育和具有區域化特點的弱毒株系篩選已引起我國相關科研工作者的高度重視。而目前僅用低效率的電鏡觀察、RT-PCR方法和核酸雜交、RT-PCR等方法對小樣本進行病毒檢測。本發明以原核表達的CTV衣殼蛋白（CP）為抗原通過雜交瘤技術制備了1株抗CTV的特異性單克隆抗體，以制備的單抗為核心建立了檢測CTV的高通量的血清學方法，并成功應用于田間CTV的檢測，從而為我國柑橘衰退病毒病早期監測和預警、檢測、科學防控提供物質和技術支持。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種分泌抗柑橘衰退病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其單抗應用。

分泌抗柑橘衰退病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞株14H11，能分泌抗柑橘衰退病毒的特異性單克隆抗體，雜交瘤細胞株14H11于2014年7月3日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC?No.9335；

雜交瘤細胞株分泌的抗柑橘衰退病毒的單克隆抗體腹水間接ELISA效價達10^-8，抗體類型及亞類為IgG1、kappa鏈，該單克隆抗體能與柑橘衰退病毒的外殼蛋白亞基有特異性免疫結合反應，該單抗檢測病葉的靈敏度達到1:10240倍稀釋；

雜交瘤細胞株14H11分泌的抗柑橘衰退病毒的單克隆抗體僅與柑橘衰退病毒有特異性免疫反應，而與柑橘碎葉病毒、柑橘裂皮病類病毒、柑橘花葉病毒、柑橘皺葉病毒、柑橘粗糙病毒、柑橘鱗皮病毒、香蕉線條病毒、黃瓜花葉病毒、番茄花葉病毒、齒蘭環斑病毒、黃瓜綠斑駁花葉病毒、小西葫蘆黃化花葉病毒、煙草花葉病毒、瓜類褪綠黃化病毒、菜豆普通花葉病毒、蕪菁花葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯A病毒、馬鈴薯S病毒、油菜花葉病毒、番茄斑萎病毒、建蘭花葉病毒、水稻黑條矮縮病毒、南方水稻黑條矮縮病毒、小麥線條花葉病毒、甘蔗花葉病毒均不發生免疫反應。

抗柑橘衰退病毒單克隆抗體在該病毒檢測上的應用是以單克隆抗體為核心建立的各種免疫學檢測方法和免疫學試劑盒。

本發明與現有技術相比具有的有益效果：1）提供的雜交瘤細胞株能分泌抗柑橘衰退病毒的特異性單克隆抗體，以該單抗為核心建立的dot-ELISA和TAS-ELISA等免疫學方法及用這些方法建立的試劑盒能高度特異、準確、靈敏的檢測柑橘衰退病毒；2）利用本發明所制備的單克隆抗體檢測柑橘衰退病毒，不需要昂貴的電子顯微鏡、PCR儀等設備；3）利用本發明所制備的單克隆抗體，可有效地用于田間植物中柑橘衰退病毒的檢測。