[發明專利]一種鰻弧菌快速檢測系統的制備與應用

在審

• 申請號: 201410624014.0
• 申請日: 2014-11-07
• 公開（公告）號: CN105628921A
• 公開（公告）日: 2016-06-01
• 發明（設計）人: 肖婧凡;王倩倩;姚曈暉;麥祺;陳捷;張元興
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

技術領域

本發明涉及生物技術和免疫學領域，更具體地，本發明涉及一種鰻弧菌快速檢測系統的制備與應用。

背景技術

鰻弧菌(Vibrioanguillarum)是目前在水產養殖業中具有極大危害的革蘭氏陰性桿菌，能夠感染包括海水魚和淡水魚在內的多種魚類。該菌在世界不少國家和地區都引起了不同程度的病害爆發，近年來給我國水產養殖業造成了極大的危害。

建立鰻弧菌快速、簡單、準確的檢測方法，對水產養殖品種鰻弧菌病害控制具有重要的意義。目前，傳統的檢測方法，是對病原微生物富集，根據菌落形態特征和生理生化特征或結合16SrDNA測序來判定病原種類。此外，免疫學檢驗技術被廣泛的應用到病原微生物的檢測中。包括細菌凝集實驗、免疫擴散實驗、免疫熒光技術、免疫印跡技術、酶聯免疫吸附技術(ELISA)等。部分研究工作者采用免疫學檢驗方法對鰻弧菌進行檢測，建立了鰻弧菌免疫組化檢驗方法、(間接)酶聯免疫吸附法(ELISA)等檢測方法。近幾年，有人報道了以聚合酶鏈反應(PCR)或環介導等溫擴增技術(LAMP)對鰻弧菌特異性基因進行檢測。

傳統的細菌學生理生化鑒定方法費時繁瑣，而一般的免疫酶試驗、免疫熒光法及ELISA等方法雖然可以用于鰻弧菌的檢測，但其操作程序較復雜、檢測相對費時費力。PCR技術簡便、快速、敏感性高，但對儀器設備及操作技能均要求較高，在水產養殖的基層單位難以大面積推廣，LAMP技術雖然不需要特殊儀器設備，但操作時易出現假陽性。

20世紀90年代初，膠體金免疫層析技術(GICA)逐漸發展起來。該方法是一種以膠體金為標記物的快速免疫結合分析技術，具有特異性強、靈敏度高、簡便快速、肉眼判讀、穩定性高等優點。相比較傳統的幾種鰻弧菌的檢測方式，膠體金免疫技術在檢測時間以及操作簡便性上占了極大的優勢。但是，膠體金免疫技術需要借助特異性良好、靈敏度良好且適用于制備金標抗體的抗體作為制備基礎。

發明內容

本發明的目的在于提供一種鰻弧菌快速檢測系統的制備與應用。

在本發明的第一方面，提供一種用于檢測鰻弧菌的測試板，其包括固相載體，以及：(1)包被于金標墊的金標抗體，其是特異性抗鰻弧菌的單克隆抗體，其由保藏號為CCTCCNO:C201477的雜交瘤細胞株產生；和(2)包被于檢測線的抗體，其是特異性抗鰻弧菌的單克隆抗體，其由保藏號為CCTCCNO:C201478的雜交瘤細胞株產生。

在一個優選例中，所述的測試板包括：固相載體(支撐板)，以及位于固相載體上的：樣品墊，金標墊，分析膜，吸水墊；所述的分析膜上設置檢測線和質控線。

在另一優選例中，所述的質控線上標記與鰻弧菌抗體免疫源相同的羊抗鼠第二抗體。

在另一優選例中，所述的固相載體是PVC塑料板。

在另一優選例中，所述的分析膜為硝酸纖維素膜。

在另一優選例中，所述的測試板的固相載體上，所述的樣品墊，金標墊，分析膜，吸水墊是有序排列的，使得樣品在加樣于樣品墊后，依次流經金標墊、分析膜、吸水墊。

在另一優選例中，所述測試板上各組件的疊放順序為：固相載體置于最底層，其上黏貼有分析膜；分析膜兩端分別放置膠體金結合墊和吸水紙，膠體金結合墊和吸水紙均與分析膜重合3±1mm；膠體金結合墊的另一端放置樣品墊，樣品墊與膠體金結合墊重合3±1mm。

在另一優選例中，所述吸水墊為濾紙纖維。

在另一優選例中，金標抗體以0.3±0.1mg/mL的量均勻涂布于玻璃纖維素膜、聚酯膜或濾紙纖維，獲得金標墊；

包被于檢測線的抗體以1±0.2mg/mL的濃度、以2±0.3μL/cm噴涂于硝酸纖維素膜上預定的檢測線位置。

在本發明的另一方面，提供所述的測試板的用途，用于檢測鰻弧菌，或用于制備檢測鰻弧菌的試劑盒。

在本發明的另一方面，提供一種用于檢測鰻弧菌的檢測試劑盒，其中包括所述的用于檢測鰻弧菌的測試板。

在本發明的另一方面，提供特異性識別鰻弧菌的單克隆抗體，其是由保藏號為CCTCCNO:C201477的雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體；和/或其是由保藏號為CCTCCNO:C201478的雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體。

在本發明的另一方面，提供產生特異性識別鰻弧菌的單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其在中國典型培養物保藏中心的保藏號是CCTCCNO:C201477；和/或其在中國典型培養物保藏中心的保藏號是CCTCCNO:C201478。