[發(fā)明專(zhuān)利]一株發(fā)根根瘤菌及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410620034.0
• 申請(qǐng)日: 2014-11-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104403966B
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-12-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 杜麗琴;閉海;裴建新;龐浩;江民華;唐婷婷;林厚民;韋宇拓
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 廣西大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/20
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/20;C12P19/04;C12R1/41
• 代理公司: 北京中譽(yù)威圣知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司11279
• 代理人: 王正茂

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體是一株發(fā)根根瘤菌(Rhizobium rhizogenes)gxas-815，是從廣西北海潿洲島采集樣品篩選獲得，該菌株可應(yīng)用于以蔗糖為主要原料的發(fā)酵培養(yǎng)基生產(chǎn)多糖。

背景技術(shù)

微生物多糖主要指大部分細(xì)菌、少量真菌和藻類(lèi)產(chǎn)生的多糖，其在細(xì)胞內(nèi)主要有三種存在形式：胞壁多糖、胞外多糖和胞內(nèi)多糖。其中胞外多糖易于與菌體分離、產(chǎn)量大、可通過(guò)深層發(fā)酵實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，而得到廣泛關(guān)注。微生物多糖由于具有安全性高、副作用小、理化特性獨(dú)特等優(yōu)點(diǎn)而使其在食品和非食品工業(yè)備受關(guān)注，可作為穩(wěn)定劑、膠凝劑、增稠劑、成膜劑、乳化劑、懸浮劑和潤(rùn)滑劑等廣泛應(yīng)用于石油、化工、食品和制藥等各個(gè)行業(yè)。

1936年Shear發(fā)現(xiàn)多糖對(duì)腫瘤抵抗活性，微生物多糖在醫(yī)藥領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力。據(jù)研究報(bào)道，微生物多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗癌癥、抗病毒的功效，通過(guò)生物工程手段對(duì)產(chǎn)多糖微生物的代謝途徑進(jìn)行改造，使這些基因工程菌株能夠合成新的高效廣譜抗病毒、抗細(xì)菌的多糖，這將是糖工程的重點(diǎn)研究方向之一。因微生物多糖適合產(chǎn)業(yè)化、規(guī)模化生產(chǎn)并且生產(chǎn)成本相對(duì)低廉，與生物化工修飾相結(jié)合來(lái)獲得高效、具有廣譜抗病毒、病菌的多糖藥物，將會(huì)產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

微生物多糖主要是以淀粉為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵進(jìn)行生產(chǎn)。能夠產(chǎn)生微生物胞外多糖的微生物種類(lèi)較多，但是真正有應(yīng)用價(jià)值并已進(jìn)行或接近工業(yè)化生產(chǎn)的僅十幾種。隨著對(duì)微生物多糖研究的不斷深入，世界上微生物多糖的產(chǎn)量和年增長(zhǎng)量在10％以上，而一些新興多糖年增長(zhǎng)量在30％以上。

根瘤菌與宿主植物的共生結(jié)瘤過(guò)程，需要各種多糖類(lèi)物質(zhì)的參與，并能產(chǎn)生胞外多糖(EPS)、莢膜多糖(KPS)、脂多糖(LPS)和環(huán)狀葡聚糖四種多糖類(lèi)物質(zhì)。根瘤菌體表的胞外多糖不僅具有富集環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)元素的功能，還對(duì)于無(wú)定型根瘤的共生固氮過(guò)程具有重要作用，它可以作為根瘤菌與宿主植物相互作用時(shí)的信號(hào)分子，在協(xié)助根瘤菌吸附宿主根毛、改變宿主根毛細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)、促進(jìn)侵入線形成、決定宿主專(zhuān)一性、保護(hù)自身抵御宿主防御系統(tǒng)反應(yīng)等共生過(guò)程中具有更為復(fù)雜的作用。根瘤菌除了作為具有固氮功能的微生物材料加以研究外，對(duì)其產(chǎn)生的胞外多糖也引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視。

鑒于許多生物活性多糖具有調(diào)節(jié)人體生理功能與增強(qiáng)免疫力的作用，在抗癌與抗病毒病方面顯示出了極大的潛力，活性多糖的研究已成為國(guó)內(nèi)外的熱點(diǎn)課題。根瘤菌胞外多糖的研究在國(guó)際上有著廣泛、持續(xù)的興趣。首先是由于根瘤菌胞外多糖對(duì)根瘤菌與它們寄主植物間的專(zhuān)一性起著重要的作用比火根瘤菌的血清學(xué)專(zhuān)一性也依賴于它們的多糖；其次根瘤菌中的許多菌株能產(chǎn)生大粘度的或具有某些特殊流變學(xué)性能的胞外多糖。韓勇等獲得一株錦雞兒根瘤菌(Rhizobium sp.N613)，能產(chǎn)生豐富的胞外多糖(REPS)，試驗(yàn)表明：該多糖具有良好的增稠性和免疫活性，有望作為食品增稠劑和免疫功能增強(qiáng)劑。

現(xiàn)有技術(shù)中有關(guān)發(fā)根根瘤菌應(yīng)用的相關(guān)報(bào)道，只有將發(fā)根根瘤菌制成菌劑用于防治番茄青枯病，而未見(jiàn)發(fā)根根瘤菌其它用途的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一株發(fā)根根瘤菌(Rhizobium rhizogenes)gxas-815及其應(yīng)用。

本發(fā)明的發(fā)根根瘤菌(Rhizobium rhizogenes)gxas-815的保藏編號(hào)為CCTCC NO.M 2013326，其是從廣西北海潿洲島采集樣品篩選獲得的，其分離篩選步驟如下：

(1)采樣：從廣西北海潿洲島采集土壤樣品；

(2)富集：每個(gè)樣品各稱(chēng)取1g分別置于富集培養(yǎng)基中，于30℃搖床、220轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)72小時(shí)，挑選發(fā)酵醪粘度較高進(jìn)行初篩；

(3)初篩：將發(fā)酵醪粘度較高的樣品稀釋涂布初篩平板培養(yǎng)基上，將涂布好樣品的初篩平板置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，挑選菌落較大、表面隆起、乳白色或半透明，邊緣整齊，具光澤的菌落進(jìn)行復(fù)篩；

(4)復(fù)篩：從初篩培養(yǎng)基平板上挑選單菌落接種于蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，將已接種好單菌落的發(fā)酵三角瓶置于30℃搖床、220轉(zhuǎn)/分發(fā)酵72小時(shí)，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行離心、沉淀、烘干、稱(chēng)量、分析，最終選定一株利用蔗糖發(fā)酵生產(chǎn)多糖產(chǎn)量較高的菌株；

(5)鑒定：該菌株經(jīng)16S rRNA鑒定為發(fā)根根瘤菌(Rhizobium rhizogenes)。