[發(fā)明專利]一種定量測(cè)定兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶活性的方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410618276.6
• 申請(qǐng)日: 2014-11-05
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105624268B
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-03-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊凌;夏楊柳;葛廣波;王平;錢星凱;竇同意
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/48
• 分類號(hào): C12Q1/48
• 代理公司: 沈陽(yáng)晨創(chuàng)科技專利代理有限責(zé)任公司 21001
• 代理人: 張晨

一種定量測(cè)定兒茶酚?O?甲基轉(zhuǎn)移酶活性的方法及其應(yīng)用，屬生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。該方法采用4?乙酸?7,8?二羥基香豆素為COMT酶的特異性探針底物，該底物可被COMT酶專一性催化生成8?甲氧基產(chǎn)物并在520nm處顯示熒光信號(hào)，通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度的變化可定量測(cè)定COMT的活性。本發(fā)明不僅可用于不同來(lái)源生物樣本中COMT酶活的定量評(píng)估，還可用于體外快速篩選COMT的抑制劑并評(píng)估其抑制能力。該方法可用于各類體外生物樣品中COMT酶真實(shí)活力的定量評(píng)估，實(shí)現(xiàn)抑制劑的快速篩選及抑制能力的定量評(píng)價(jià)；可用于評(píng)價(jià)不同種屬COMT及具有不同氨基酸序列的COMT突變體的催化活性，進(jìn)而評(píng)估其代謝兒茶酚類藥物的能力。本發(fā)明方法具有(1)高選擇性，(2)廉價(jià)易得；(3)高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種定量測(cè)定兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶活性的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)是哺乳動(dòng)物體內(nèi)廣泛分布的一種甲基化轉(zhuǎn)移酶，其主要生理功能是負(fù)責(zé)代謝內(nèi)源性的神經(jīng)遞質(zhì)(如腎上腺素，去甲腎上腺素以及多巴胺等)和外源性的兒茶酚類藥物(如卡比多巴，芐絲肼，阿撲嗎啡，多巴酚丁胺，非諾多泮，α-甲基-L-DOPA，異丙腎上腺素和利米特羅等)。在人體中，COMT酶有兩種存在形式，一種是溶解性的COMT(S-COMT)，另一種是膜結(jié)合型的COMT(MB-COMT)。COMT在人體的多種組織中都有分布，如腎臟，肝臟，肺等，在人體的大腦中，主要存在于突觸后神經(jīng)元。在人體的大多數(shù)組織中，而S-COMT的量是MB-COMT的3-4倍左右。在人腦中，COMT酶主要以MB-COMT的形式存在，占總量的70％，S-COMT占30％。

COMT酶的活性在人體中呈基因多態(tài)性，分別表現(xiàn)為低活性(COMT^LL)，中等活性(COMT^LH)和高活性(COMT^HH)。有研究表明，人體中的COMT活性和疼痛，乳腺癌及一些精神類疾病都有相關(guān)性。當(dāng)人腦中的COMT活性偏高時(shí)，大腦中前額葉皮質(zhì)中的神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺清除增加，認(rèn)知能力削弱，導(dǎo)致精神分裂癥的發(fā)生；而大腦中的COMT活性偏低時(shí)，則容易造成強(qiáng)迫癥，焦慮癥，恐慌癥以及對(duì)疼痛的敏感。當(dāng)人乳腺中COMT活性偏低時(shí)，雌二醇等雌激素?zé)o法代謝，其高暴露直接導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生。因此，定量測(cè)定人體組織及細(xì)胞中的COMT活性對(duì)于多種疾病的臨床診斷和治療具有重要指導(dǎo)意義。另外，由于COMT還是帕金森病治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)，利用COMT定量評(píng)價(jià)方法并借助體外代謝孵育體系可高通量的篩選和評(píng)價(jià)COMT抑制劑，對(duì)于帕金森病治療藥物的發(fā)現(xiàn)意義重大。

目前，最常用的COMT酶活性的檢測(cè)方法是采用原兒茶酸，左旋多巴，多巴胺或腎上腺素作為底物，利用高效液相色譜或質(zhì)譜對(duì)其甲基化產(chǎn)物進(jìn)行定量，從而評(píng)估COMT酶的活性。由于色譜或質(zhì)譜方法成本昂貴，樣品分析時(shí)間較長(zhǎng)，因此難以實(shí)現(xiàn)樣品的高通量檢測(cè)。此外，以上檢測(cè)方法中所用的探針底物包括原兒茶酸在哺乳動(dòng)物COMT酶的催化下分別生成兩個(gè)單甲基化產(chǎn)物，而兩個(gè)產(chǎn)物由于結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)相近，在液相色譜上通常難以分離，給其定量檢測(cè)帶來(lái)了不便。因此，急需尋找定量方便，檢測(cè)靈敏的COMT酶活性評(píng)價(jià)方法。

目前，COMT的體外評(píng)價(jià)體系主要包括哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞，以及亞細(xì)胞組分等，其中亞細(xì)胞組分主要包括肝臟組織的S9、胞漿以及腦組織勻漿等成分。采用這些標(biāo)準(zhǔn)化的評(píng)價(jià)體系，結(jié)合相應(yīng)的輔因子(SAM)和孵育條件，可通過(guò)檢測(cè)探針底物的代謝清除或產(chǎn)物生成速率，對(duì)上述各種體系中表達(dá)的COMT酶活性進(jìn)行表征。

本發(fā)明中所用的COMT底物4-乙酸-7,8-二羥基香豆素具有代謝產(chǎn)物單一(僅生成一個(gè)8-O-甲基化產(chǎn)物)、代謝路徑單一(只被COMT催化，不發(fā)生葡萄糖醛酸化和磺酸化反應(yīng))、代謝產(chǎn)物易于檢測(cè)且靈敏度高等特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種定量測(cè)定兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶活性的方法及其應(yīng)用，該方法中所用的探針底物沒(méi)有熒光發(fā)射，而甲基化產(chǎn)物具有較強(qiáng)的熒光發(fā)射，熒光量子產(chǎn)率較高易于檢測(cè)。利用該方法可對(duì)多種生物體系中COMT的分布和功能進(jìn)行定量評(píng)價(jià)。