[發(fā)明專(zhuān)利]鱘魚(yú)虹彩病毒TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410617814.X
• 申請(qǐng)日: 2014-11-04
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104328219A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-02-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周勇;曾令兵;孫愛(ài)義;解旭東;范玉頂;徐進(jìn);馬杰
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所;鎮(zhèn)江水中仙漁業(yè)發(fā)展有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/70
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 武漢宇晨專(zhuān)利事務(wù)所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于鱘魚(yú)病害檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種鱘魚(yú)虹彩病毒TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，該P(yáng)CR試劑盒不僅可使用目前存在市場(chǎng)上的所有類(lèi)型熒光定量PCR儀器，更重要的是能快速地對(duì)鱘魚(yú)虹彩病毒進(jìn)行定量檢測(cè)。同時(shí)還涉及一種鱘魚(yú)虹彩病毒TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒的用途。

技術(shù)背景

鱘魚(yú)隸屬于硬骨魚(yú)綱(Osteichthyes)輻鰭亞綱(Actinopterygii)軟骨硬鱗總目(Chon?drostei)鱘形目(Acipenseriformes)，是現(xiàn)存的古老生物種群，廣泛分布于北半球。全世界現(xiàn)有鱘魚(yú)2科6屬26種，我國(guó)分布有8種，主要分布于長(zhǎng)江流域、黑龍江流域和新疆3個(gè)區(qū)域。隨著鱘魚(yú)野生資源的不斷減少，為了保護(hù)鱘魚(yú)資源，我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖研究人員和養(yǎng)殖者積極開(kāi)展鱘魚(yú)的人工繁殖和養(yǎng)殖工作，目前國(guó)內(nèi)已開(kāi)展的養(yǎng)殖品種有中華鱘(Acipense?r?sinensis?Gray)、施氏鱘(A.schrenckii?Brandt)、達(dá)氏鱘(A.dabryanusDuneril)等，但是隨著鱘魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，鱘魚(yú)的疾病也日漸增多，主要是由細(xì)菌和寄生蟲(chóng)引起[田甜,楊元金,王京樹(shù),張旭.鱘魚(yú)病害研究進(jìn)展[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,51(3):559-562.]。國(guó)外對(duì)鱘魚(yú)病毒性疾病的研究相對(duì)起步較早，已報(bào)道有四種可感染鱘魚(yú)并在魚(yú)體內(nèi)分離到的病毒，他們分別是高首鱘虹彩病毒(white?sturgeon?iridovirus,WSIV)，高首鱘皰疹病毒-I，II(white?st?urgeon?herpesviruses-I,II,WSHV-I,II)和鏟鱘虹彩病毒(Shovenose?sturgeon?iridovirus，SSI?V)[王獲,劉紅柏,盧彤巖,華育平,孫大江.鱘魚(yú)病毒性疾病研究進(jìn)展[J].水產(chǎn)學(xué)雜志,2008,21(2):84-89.]，其中WSIV引起的鱘魚(yú)病毒性疾病發(fā)病率和死亡率最高。隨著鱘魚(yú)的人工養(yǎng)殖迅速發(fā)展，引種雜交和高密度養(yǎng)殖可能導(dǎo)致國(guó)內(nèi)鱘魚(yú)病毒病的爆發(fā)，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，有必要建立一種準(zhǔn)確、快速、靈敏的檢測(cè)方法對(duì)其進(jìn)行監(jiān)控，保證鱘魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。近年來(lái)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time?fluorescent?quantitative?PCR)以其特異性高、靈敏度高、可定量、有效解決PCR污染問(wèn)題及自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、微生物和動(dòng)植物疾病檢疫方面得到了廣泛應(yīng)用。筆者針對(duì)鱘魚(yú)危害最嚴(yán)重的高首鱘虹彩病毒病建立了檢測(cè)高首鱘虹彩病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，旨在對(duì)高首鱘虹彩病毒進(jìn)行快速定性和定量檢測(cè)。而傳統(tǒng)的PCR法約需7個(gè)小時(shí)左右才能完成。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是在于提供了一種高首鱘虹彩病毒TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，該P(yáng)CR試劑盒不僅可使用目前存在市場(chǎng)上的所有類(lèi)型熒光定量PCR儀器，更重要的是能快速地對(duì)高首鱘虹彩病毒進(jìn)行定量檢測(cè)。一次可檢測(cè)32-384個(gè)樣品，這樣也減少了人力資源的浪費(fèi)。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了一種高首鱘虹彩病毒TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒在高首鱘虹彩病毒病原檢測(cè)中的應(yīng)用，熒光定量PCR方法定量重復(fù)性好，定量準(zhǔn)確，而且，熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒對(duì)樣品的檢測(cè)僅需2-3個(gè)小時(shí)就能完成，使用該試劑盒可以大大縮短檢測(cè)時(shí)間。

為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施：

一種高首鱘虹彩病毒TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括以下組分：

A).陽(yáng)性模板pMCP

為含有高首鱘虹彩病毒MCP基因519個(gè)核苷酸片段(SEQ?ID?NO.4所示)的pM?D19-T載體，即質(zhì)粒pMCP。該載體可在大腸桿菌E.coli?DH5?a中增殖。

B).熒光定量反應(yīng)液：

10×Taq反應(yīng)緩沖液、dNTPs、正向引物和反向引物、熒光探針、Taq?DNA聚合酶、無(wú)菌雙蒸水。

正向引物為5′-TCTCGCTTCCTGTCGTCG-3′；

反向引物為5′-AGTTGGGCGTCAGCTTGG-3′；

熒光探針：5′-FAM-ACTGTGCCAATGCTCTCAAACGAAT-ROX-3′。

優(yōu)選的，熒光定量反應(yīng)的體系為：

10×Taq反應(yīng)緩沖液2μl、2.5mmol/L?dNTPs?0.4μl、50μmol/L正向引物和反向引物各0.4μl、25μmol/L的熒光探針0.4μl、5U/μl?Taq?DNA聚合酶0.4μl、無(wú)菌雙蒸水14μl，待測(cè)樣品2μl。