[發(fā)明專利]一個水稻鋅指蛋白基因的抗白葉枯病基因工程應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410614799.3
• 申請日: 2014-11-04
• 公開（公告）號: CN104357478A
• 公開（公告）日: 2015-02-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黃驥;張紅生;藍虹霞;鮑永美;王州飛;唐海娟
• 申請（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N5/10;C12N15/84;C12Q1/68;A01H5/00
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤

1.一種重組載體，其特征在于：該載體包括序列如SEQ?ID?NO.1所示的A20/AN1鋅指蛋白基因ZFP181，通過DNA連接酶將基因ZFP181連接到植物表達載體，能夠過量表達A20/AN1鋅指蛋白ZFP181。

2.包括權(quán)利要求1所述重組載體的轉(zhuǎn)化細胞。

3.一種鋅指蛋白基因ZFP181過量表達轉(zhuǎn)基因水稻的培育方法，其特征在于：該方法包括如下步驟：

(1)重組質(zhì)粒pMD18T-ZFP181的獲得

選用水稻粳稻品種韭菜青，參照Invitrogen公司的Trizol法提取總RNA，參照Ferments公司反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成韭菜青cDNA第一鏈；設(shè)計基因克隆引物，以反轉(zhuǎn)錄獲得的韭菜青cDNA為模板，通過PCR擴增ZFP181基因全長；通過TA-克隆系統(tǒng)將ZFP181基因片段連接到pMD18-T載體，獲得重組質(zhì)粒pMD18T-ZFP181；

(2)重組質(zhì)粒pCAMBIA1304-ZFP181的獲得

根據(jù)ZFP181基因序列，以步驟(1)中獲得的重組質(zhì)粒pMD18T-ZFP181為模板，設(shè)計引物對，通過PCR擴增ZFP181基因全長；利用Nco?I與BstP?I將ZFP181全長正向插入植物雙元表達載體pCAMBIA1304的CaMV?35S啟動子下游，獲得重組質(zhì)粒pCAMBIA1304-ZFP181；

(3)轉(zhuǎn)基因植株獲得

將獲得的重組載體pCAMBIA1304-ZFP181轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105；以水稻粳稻品種中花11為受體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化將重組載體pCAMBIA1304-ZFP181中包含目的基因ZFP181的T-DNA區(qū)整合到水稻基因組中，從而獲得ZFP181過量表達轉(zhuǎn)基因植株。

4.權(quán)利要求3所述的鋅指蛋白基因ZFP181過量表達轉(zhuǎn)基因水稻的培育方法，其特征在于：步驟(1)重組質(zhì)粒pMD18T-ZFP181的獲得過程中使用的引物對，上游引物ZFP181F：5′-AACCCATTCCCAAAAGCA-3′，下游引物ZF?181R：5′-CCATCCAACTTCCAACCTCA-3′；步驟(2)重組質(zhì)粒pCAMBIA1304-ZFP181的獲得過程中，設(shè)計的引物對為ZFP181F-30a：5′-TCTCGGATTCGACCATGGC-3′；ZFP181Rs：5′-GAGGTAACCGGAAAATTC?AGGTTG-3′。

5.轉(zhuǎn)鋅指蛋白基因ZFP181水稻的鑒定方法，其特征在于：該方法包括如下步驟(1)設(shè)計轉(zhuǎn)基因檢測引物對：LacZ-F：5′-GGCTCGTATGTTGTGTGGAA-3′，181RT2-R：5′-AGTCGTGGCGGTCGGAGTA-3′；對待檢測的轉(zhuǎn)基因水稻DNA進行PCR檢測，能夠擴增出1313bp?DNA片段的植株即為ZFP181過量表達轉(zhuǎn)基因水稻陽性植株；

(2)設(shè)計ZFP181基因特異引物181RT4-F：5′-AGGAG?CCGACGG?AGCTGAGG-3′與181RT4-R：5′-TTGTTGGTCGCCGGGTTGCC-3′及內(nèi)參基因18S?rRNA引物18S-F：5′-ATGGTGGTGACGGGTGAC-3′，18S-R：5′-CAGACACT?AAAGCGCCCGGTA-3′，以野生型水稻作對照，對待檢測轉(zhuǎn)基因水稻進行實時熒光定量PCR分析；通過與野生型對照相比，ZFP181基因的表達高于野生型對照的植株即為ZFP181過量表達轉(zhuǎn)基因水稻陽性植株；

(3)提取待檢測轉(zhuǎn)基因植株DNA并利用EcoR?I對各個轉(zhuǎn)基因株系基因組DNA進行酶切，以hptII基因編碼區(qū)內(nèi)583bp?DNA序列為模板，通過隨機引物擴增獲得地高辛標(biāo)記的探針，進行Southern雜交分析，具有陽性檢測條帶的待檢測轉(zhuǎn)基因水稻為ZFP181過量表達轉(zhuǎn)基因水稻陽性植株。

6.序列如SEQ?ID?NO.1所示的A20/AN1鋅指蛋白基因ZFP181在抗白葉枯病水稻育種上的應(yīng)用，其特征在于：增強所述的A20/AN1鋅指蛋白基因ZFP181的表達，能夠提高水稻的抗白葉枯病性。

7.權(quán)利要求1所述的重組載體在抗白葉枯病水稻育種上的應(yīng)用。

8.權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)化細胞在抗白葉枯病水稻育種上的應(yīng)用。

9.權(quán)利要求3-4任一項所述培育方法在抗白葉枯病轉(zhuǎn)基因水稻育種上的應(yīng)用。

10.根據(jù)權(quán)利要求3-4任一項所述方法制成的轉(zhuǎn)基因水稻在抗白葉枯病上的應(yīng)用。