[發明專利]一種來源于綠色巴夫藻的delta12去飽和酶新基因

有效

• 申請號: 201410611541.8
• 申請日: 2014-11-04
• 公開（公告）號: CN104388442B
• 公開（公告）日: 2016-11-23
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 徐毅
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

?本申請屬于基因克隆分離的技術領域，尤其涉及于一種來源于微藻的有關多不飽和脂肪酸合成的去飽和酶基因及其分離方法。

背景技術

多不飽和脂肪酸是人體必需的重要的營養物質，微藻因富含多不飽和脂肪酸而成為重要的生物資源。綠色巴夫藻?(Pavlova?viridis)含有豐富的多不飽和脂肪酸，是進行多不飽和脂肪酸相關合成基因識別與克隆的良好實驗材料。

RACE全稱rapid-amplification?of?cDNA?ends，是一種常用的通過PCR進行cDNA末端快速克隆的技術。本實驗采用RACE技術來獲得目的mRNA片段的全長序列。

在微藻的多不飽和脂肪酸的體內合成途徑中，起到最關鍵作用的是多不飽和脂肪酸去飽和酶和多不飽和脂肪酸延伸酶兩大酶類。但由于其為與內質網結合的膜蛋白，上述酶類在分子水平上的研究受到很大限制。其中，delta12去飽和酶是催化油酸（十八碳一烯酸）生成亞油酸（十八碳二烯酸）的關鍵酶，該酶因直接催化了單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸的轉化過程而具有較大的研究價值。目前在微藻中已經有數個來自于不同物種的delta12去飽和酶獲得了分離和識別，但不同物種的同源酶顯然都存在序列上和結構上的差異，進而導致其酶活性和功能的不同。因此，從綠色巴夫藻中分離得到其delta12去飽和酶的同源酶是對該部分研究資源的很好補充，本申請就試圖從這個角度展開相關的工作。

發明內容

綠色巴夫藻?(Pavlova.?viridis)?為常用微藻，購自中國科學院青島海洋研究所。

綠色巴夫藻delta12去飽和酶基因的分離過程為：

(1)?利用本領域常規的mRNA提取分離手段獲得綠色巴夫藻的總mRNA，并使用引物OligodT以本領域常規手段將之反轉錄為cDNA;

(2)?使用cDNA作為模板，根據delta12去飽和酶同源基因的保守性設計引物P12F、P12R來進行保守區基因的擴增,其引物序列為:P12F：5’-CTGACGGTGGTCATCGCAGG-3’;?P12R:?5’-CATGACACAACATCTGAAGA-3’;?PCR反應條件為：94oC?3?min；94oC?30?s,?57oC?30?s,?72oC?1?min,?30個循環；72oC?10?min;?所獲PCR產物大小約為449bp；

(3)?3’末端的擴增反應以cDNA為模板、使用SMART?RACE?cDNA擴增試劑盒來進行，使用的擴增引物分別是：UPM?(10×universal?primer?mix);?des12-3?GGCAGGCTCGGGCATCCTGT。梯度PCR反應程序為:?94oC?3?min;?94oC?30?s,?72oC?3?min,?5個循環；94oC?30?s,?70oC?30?s,?72oC?3?min,?5個循環；94oC?30?s，68oC?30?s，72oC?3?min，?30個循環；72oC?10?min。所獲PCR產物大小約為?550?bp.

（4）5’末端的擴增反應使用總mRNA為模板并使用SMART?RACE?cDNA擴增試劑盒來進行，使用的引物分別為：UPM5’(10×universal?primer?mix);?GSP1?GCGGCACGGACATCGATGA;?GSP2

AATCACCCAGACGCCTGTC。反應程序為：加入GSP1于mRNA中后以94oC?3?min;?94oC?30?s,?60oC?30s,?72oC1?min反應1個循環；隨后加入TdT于37oC反應30min獲得特定末端產物；然后向體系中加入UPM5’和GSP2,?以如下程序完成反應：94oC?3?min;?94oC?30?s,?72oC?3?min,?5個循環；94oC?30?s,?70oC?30?s,?72oC?3?min,?5個循環；94oC?30?s，68oC?30?s，72oC?3?min，?30個循環；72oC?10?min。所獲目的片段約為670bp。

以上所有的片段均連入pMD18T載體后進行測序后拼接。