[發(fā)明專利]一種以綠豆為原料制備甘露三糖和甘露四糖的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410608110.6
• 申請(qǐng)日: 2014-10-29
• 公開（公告）號(hào): CN104450824A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曾曉雄;戴竹青
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12P19/00
• 分類號(hào): C12P19/00
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• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種以轉(zhuǎn)化酶進(jìn)行酶解反應(yīng)，利用中壓柱層析、Biogel?P-2凝膠過(guò)濾層析柱，以綠豆為原料制備甘露三糖和甘露四糖的方法。?

背景技術(shù)

功能性低聚糖是益生元的一種，通常由2-10個(gè)單糖分子以糖苷鍵連接而成的低度聚合糖，它的分子量在200-2000之間。益生元的定義為“通過(guò)選擇性的增殖一種或少數(shù)種菌落中的細(xì)菌的生長(zhǎng)與活性而對(duì)寄主產(chǎn)生有益的影響從而改善寄主健康的不可被消化的食品成分”。因人體腸道內(nèi)不具備相應(yīng)的分解消化的酶系統(tǒng)，所以低聚糖本身不能被機(jī)體消化吸收，而是直接進(jìn)入到大腸被大腸菌群利用，具有低熱量、抗齲齒、防治糖尿病、提高免疫力、改善腸道菌落結(jié)構(gòu)等生理作用。主要的功能性低聚糖包括低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖等。?

棉子糖家族低聚糖(RFOs)是α-低聚半乳糖的重要組成之一，其結(jié)構(gòu)是在蔗糖的葡萄糖殘基一側(cè)以α-(1→6)糖苷鍵連接一個(gè)或多個(gè)半乳糖分子構(gòu)成的低聚糖，如三糖的棉籽糖、四糖的水蘇糖、五糖的毛蕊花糖、六糖的筋骨草糖等。甘露三糖(Galα(1→6)Galα(1→6)Glc)和甘露四糖(Galα(1→6)Galα(1→6)Galα(1→6)Glc)結(jié)構(gòu)與RFOs的水蘇糖和毛蕊花糖結(jié)構(gòu)相似，分別是在葡萄糖一側(cè)以α-(1→6)糖苷鍵分別連接兩個(gè)和三個(gè)半乳糖分子。目前關(guān)于甘露三糖和甘露四糖的研究較少，也很少在天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)此類低聚糖。然而研究表明在許多天然植物中含有棉子糖家族低聚糖，尤其是在豆類植物中棉子糖家族低聚糖的含量很高。同時(shí)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)綠豆中水蘇糖和毛蕊花糖的含量高于其他豆類植物，因此如果能以綠豆為原料酶解棉子糖家族低聚糖上的果糖獲得甘露聚糖，獲得快速大量制備甘露三糖和甘露四糖的方法，將具有廣闊的應(yīng)用前景。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是以綠豆為原料，通過(guò)轉(zhuǎn)化酶進(jìn)行快速酶解反應(yīng)，利用中壓柱層析，BiogelP-2凝膠過(guò)濾層析柱，制備得到甘露三糖和甘露四糖純品。包括如下工藝步驟：?

(1)選取籽粒飽滿、無(wú)蟲害、無(wú)缺失的綠豆種子，用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)篩，得到綠豆粉用于磨粉提取。?

(2)稱取適量步驟(1)中豆粉于容器中，按一定料液加入乙醇水溶液，恒溫條件下振蕩提取。將提取液離心，收集上清液，下層豆粉重復(fù)上述步驟兩次，收集上清液，并將上清液合并。?

(3)凍干步驟(2)所得提取物加適量水復(fù)溶，加入一定量的轉(zhuǎn)化酶，55℃下恒溫進(jìn)行酶解反應(yīng)。?

(4)對(duì)步驟(3)中反應(yīng)前和反應(yīng)后的水溶性糖組成分別進(jìn)行HPLC分析，收集反應(yīng)后的組分過(guò)活性炭-硅藻土中壓層析柱進(jìn)行分離。?

(5)步驟(4)所得甘露三糖和甘露四糖粗品過(guò)Biogel?P-2凝膠過(guò)濾層析柱，收集只含有單一組分的部分，真空濃縮，冷凍干燥，分別得到甘露三糖和甘露四糖純品。?

(6)步驟(5)所得甘露三糖和甘露四糖的結(jié)構(gòu)鑒定方法為：分離純化得到的甘露三糖和甘露四糖樣品進(jìn)行ESI-TOF-MS，¹H-NMR和¹³C-NMR和分析。?

附圖說(shuō)明

圖1為綠豆水溶性糖的HPLC圖?

圖2為酶解反應(yīng)后溶液的HPLC圖?

圖3為甘露三糖的MS圖譜?

圖4為甘露三糖的¹H-NMR圖譜?

圖5為甘露三糖的¹³C-NMR圖譜?

圖6為甘露四糖的MS圖譜?

圖7為甘露四糖的¹H-NMR圖譜?

圖8為甘露四糖的¹³C-NMR圖譜?

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。?

實(shí)施例1：?