[發明專利]一種人骨髓間充質干細胞誘導分化內耳毛細胞的方法

有效

• 申請號: 201410607064.8
• 申請日: 2014-10-31
• 公開（公告）號: CN104388381B
• 公開（公告）日: 2017-08-22
• 發明（設計）人: 邵建忠;潘若浪;項黎新;劉小園;王萍
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司33201
• 代理人: 黃美娟,李世玉

1.一種人骨髓間充質干細胞誘導分化內耳毛細胞的方法，其特征在于所述方法為：取人骨髓間充質干細胞，接種至誘導液Ⅰ，在37℃，5％CO₂培養箱中誘導培養7天，然后換誘導液Ⅱ，在37℃，5％CO₂培養箱繼續培養7-10天，0.25％胰酶EDTA消化后，接種至預處理后的雞胚橢圓囊間質細胞上，加入誘導液Ⅲ，在37℃，5％CO₂培養箱繼續誘導14-21天，獲得成熟的內耳毛細胞；

誘導液Ⅰ終濃度組成：體積濃度5％FBS、45-55ng/ml IGF-1、20-30ng/ml EGF、10μM RA和20-30ng/ml FGF2，溶劑為DMEM/F12基礎培養液；

誘導液Ⅱ終濃度組成：體積濃度5％FBS、5-15ng/ml BMP4和20-30ng/ml FGF2，溶劑為DMEM/F12基礎培養液；

誘導液Ⅲ終濃度組成：體積濃度5％FBS和20-30ng/ml FGF2，溶劑為DMEM/F12基礎培養液；

所述雞胚橢圓囊間質細胞預處理方法為：將雞胚橢圓囊間質細胞用含終濃度2μg/ml絲裂霉素C的DMEM培養液浸泡，在37℃，5％CO₂培養箱培養3小時，棄去懸浮液，獲得預處理后的雞胚橢圓囊間質細胞。

2.如權利要求1所述人骨髓間充質干細胞誘導分化內耳毛細胞的方法，其特征在于所述誘導液Ⅰ終濃度組成：體積濃度5％FBS、50ng/ml IGF-1、25ng/ml EGF、10^-6M RA和25ng/ml FGF2，溶劑為DMEM/F12基礎培養液。

3.如權利要求1所述人骨髓間充質干細胞誘導分化內耳毛細胞的方法，其特征在于所述誘導液Ⅱ終濃度組成：體積濃度5％FBS、10ng/ml BMP4和25ng/ml FGF2，溶劑為DMEM/F12基礎培養液。

4.如權利要求1所述人骨髓間充質干細胞誘導分化內耳毛細胞的方法，其特征在于所述誘導液Ⅲ終濃度組成：體積濃度5％FBS和25ng/ml FGF2，溶劑為DMEM/F12基礎培養液。

5.如權利要求1所述人骨髓間充質干細胞誘導分化內耳毛細胞的方法，其特征在于所述雞胚橢圓囊間質細胞按如下方法制備：從受精18天雞胚中分離橢圓囊，0.25％胰酶，37℃消化15-20分鐘后，用添加體積終濃度10％FBS的DMEM培養液中止，過200目篩網，收集細胞懸液，1000rpm/min離心6-8分鐘，細胞用添加體積終濃度10％FBS的DMEM培養液懸浮，接種于培養瓶中，置37℃，5％CO₂培養箱培養，48小時后首次換液，棄去未貼壁細胞，貼壁繼續培養至90％匯合度，用0.25％胰酶/EDTA消化并接種至細胞培養瓶中培養，記為P1代細胞，通過如此傳代培養，至P3代，即得到雞胚橢圓囊間質細胞。

6.如權利要求1所述人骨髓間充質干細胞誘導分化內耳毛細胞的方法，其特征在于所述誘導液Ⅱ培養消化后的細胞以10⁵個/cm²的密度接種至預處理后的雞胚橢圓囊間質細胞上。