[發明專利]可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白在制備ELISA試劑中的應用及其ELISA試劑盒

有效

• 申請號: 201410606977.8
• 申請日: 2014-10-31
• 公開（公告）號: CN104297493A
• 公開（公告）日: 2015-01-21
• 發明（設計）人: 汪銘書;程安春;曹乾大;陳孝躍
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/531
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 王貴君

1.可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白在制備檢測I型鴨病毒性肝炎抗體的ELISA試劑中的應用，其特征在于，所述可溶性蛋白的制備步驟如下：將SEQ?ID?NO.3所示序列的第9～1376位核苷酸連接于pET-32(a)+載體的多克隆酶切位點處，然后以大腸桿菌Rosetta、BL21或BL21(DE3)PLYS為宿主菌，在Amp抗性的LB培養基中活化后，在IPTG終濃度為0.2～1.0mmol/L、溫度為20～39℃條件下誘導表達4～12小時，收集菌液，離心后收集菌體，將收集的菌體用20mmol/L、pH為8.0的Tris-HCl懸浮，然后在冰浴下超聲，破碎后進行離心，上清用Ni²⁺-NTA瓊脂糖凝膠柱純化，透析，超濾得可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白。

2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于：所述宿主菌為大腸桿菌BL21(DE3)PLYS。

3.根據權利要求1所述的應用，其特征在于：所述誘導表達為加入IPTG至終濃度為0.8mmol/L，在溫度為25℃條件下誘導表達6小時。

4.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述活化的具體步驟為：將表達菌株接種于Amp抗性的LB培養基中，在37℃、120r/min條件下過夜培養，然后將培養液與Amp抗性的LB培養基按體積比為1：100擴大培養至OD₆₀₀為0.6即可。

5.根據權利要求1所述的應用，其特征在于：所述冰浴下超聲為在冰浴條件下超聲破碎6次，30sec/次，每次間隔30sec。

6.檢測I型鴨病毒性肝炎抗體的ELISA試劑盒，其特征在于：所述試劑盒含有可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白包被的反應板。

7.根據權利要求6所述的ELISA試劑盒，其特征在于：所述反應板的制備方法為將1μg/mL的可溶性I型鴨肝炎病毒3D蛋白按每孔100μL加入反應板中，4℃過夜包被，次日PBST洗板5次，拍干即可。

8.根據權利要求6所述的ELISA試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還含有酶標抗體、顯色液和終止液。

9.根據權利要求6所述的ELISA試劑盒，其特征在于：所述酶標抗體為HRP標記羊抗鴨IgG或HRP標記兔抗鴨IgG，所述顯色液為TMB，所述終止液為濃度為2mol/L的H₂SO₄。