[發明專利]莖瘤芥抗逆基因BjEFh1及其植物表達載體及應用

有效

• 申請號: 201410606963.6
• 申請日: 2014-10-30
• 公開（公告）號: CN104328127A
• 公開（公告）日: 2015-02-04
• 發明（設計）人: 向瀏欣;汪露;劉吉軍;王小艷;鄭慧;鄧朝偉;高翔
• 申請（專利權）人: 重慶郵電大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/82;C07K14/415;A01H5/00
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 謝殿武

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體涉及莖瘤芥來源的抗逆基因BjEFh1及其植物表達載體及應用。

背景技術

高鹽、干旱和低溫等非生物脅迫對作物的產量及生長發育有很大影響，因此，有關植物抗逆性的研究一直是植物學研究領域的熱點之一。

莖瘤芥(Brassica?juncea?var.tumida?Tsen?et?Lee)，又稱青菜頭，是十字花科蕓薹屬植物，為榨菜的主要原料，是我國重慶、四川、浙江等地區主要的經濟作物之一。多年來，莖瘤芥的相關研究主要集中在遺傳育種、良種繁育、栽培技術、品質安全等領域，近年才陸續有生物學方面研究的報道，包括基因的克隆、功能研究以及莖瘤芥瘤狀莖膨大相關研究，企圖通過基因工程方法提高莖瘤芥的產量、質量以及抗病性、抗逆性等。

鈣離子信號在許多細胞活動，如細胞代謝、基因表達、細胞骨架動態變化、細胞周期、細胞死亡、信號傳導等過程中有重要作用。

在植物細胞中，鈣離子的作用之一是作為第二信使，很多外界環境信號，如光、生物脅迫、非生物脅迫、植物激素等都會刺激胞液中Ca²⁺濃度的增加，從而引發鈣離子信號傳導。鈣離子信號傳導途徑中首先響應的即是能結合Ca²⁺的鈣結合蛋白，其結合Ca²⁺以后會發生構想變化，使疏水面外露，從而激活或抑制其它蛋白的活性，從而引發信號傳導。具報道，鈣結合蛋白包括鈣調素、類鈣調蛋白、鈣依賴蛋白激酶等，其中對鈣調素功能研究的報道最多；但對類鈣調蛋白、鈣依賴蛋白激酶的功能研究較少，其分子機理研究更少報道。

本發明克隆了一個莖瘤芥基因BjEFh1，由于其含有1對EF-hand(簡稱EFh)結構域，而EFh結構域通常是可能結合鈣離子的結構基序，目前報道的鈣結合蛋白中，通常具有1-3對EFh結構域，因此推測本發明克隆的莖瘤芥抗逆基因BjEFh1為鈣結合蛋白家族基因。

發明內容

鑒于此，本發明的目的之一是提供莖瘤芥抗逆基因BjEFh1，該基因全長821bp，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示；通過NCBI的ORF工具檢測知其最大開放閱讀框570bp，如SEQ?ID?NO.1所示；因此，其5’端非編碼區有88bp，3’端非編碼區有163bp。

本發明的目的之二是提供莖瘤芥抗逆基因蛋白，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO.3所示，有189個氨基酸，且序列通過NCBI的保守結構域(conserved?domains)檢測知具有1對EF-hand結構域。

本發明的目的之三是提供莖瘤芥抗逆基因BjEFh1的重組植物表達載體pCAMBIA1302-BjEFh1，其由SEQ?ID?NO.1序列連入植物表達載體pCAMBIA1302構成。

本發明的目的之四是提供莖瘤芥抗逆基因BjEFh1在提高植物耐逆境特性中的應用，尤其是提高植物在高鹽條件的耐受力。

本發明通過莖瘤芥轉錄組測序獲得序列片段SEQ?ID?NO.4，然后根據片段SEQ?ID?NO.4設計巢式引物并通過RACE方法擴增獲得莖瘤芥抗逆基因BjEFh1，基因編碼189個氨基酸，NCBI比對預測具有1對EF-hand結構域，推測屬于鈣結合蛋白家族成員；通過構建BjEFh1基因植物表達載體，可直接用于農桿菌介導的遺傳轉化，創制耐逆境新種質，提高植物的逆境耐受力特性，尤其是耐鹽特性，可進行植物品種改良。

附圖說明

圖1為本發明BjEFh1基因編碼區序列PCR擴增的瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖2為本發明重組植物表達載體pCAMBIA1302-BjEFh1的構建流程圖；

圖3為本發明T1代轉BjEFh1基因擬南芥在含潮霉素(25mg/L)的MS培養基上的篩選攝影圖；

圖4為本發明轉基因型擬南芥和野生型中的BjEFh1基因表達水平檢測圖；

圖5為本發明正常條件下野生型與轉基因型擬南芥發芽率的統計圖；

圖6為本發明NaCl條件下野生型與轉基因型擬南芥發芽率的統計圖；

圖7為本發明NaCl條件下野生型與轉基因型擬南芥根的長度統計圖；

圖8為本發明NaCl條件下野生型與轉基因型擬南芥根的生長對比攝影圖；

圖9為本發明NaCl條件下轉BjEFh1基因擬南芥和野生型擬南芥耐鹽能力對比攝影圖；

圖10為本發明NaCl條件下野生型與轉基因型擬南芥的存活率統計圖。

具體實施方式