[發明專利]一種用于產志賀毒素大腸桿菌檢測的質粒標準分子及其應用

有效

• 申請號: 201410606494.8
• 申請日: 2014-10-31
• 公開（公告）號: CN104946736B
• 公開（公告）日: 2018-12-28
• 發明（設計）人: 劉剛;梁文;許麗;李妍;聞艷麗;李蘭英;任淑貞
• 申請（專利權）人: 上海市計量測試技術研究院
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/06;C12N15/31;C12N15/11;C12N15/10;C12R1/19
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 崔佳佳;陸鳳

本發明公開了一種用于產志賀毒素大腸桿菌檢測的質粒標準分子PLW03和PLW04及其應用。具體地，本發明提供了能夠用于產志賀毒素大腸桿菌PCR檢測的多核苷酸以及與之相配合的引物對，采用合適的骨架質粒將所述多核苷酸序列制備為標準質粒分子，并配合本發明的引物對進行實時熒光PCR檢測，具有極佳的特異性和靈敏度，并且穩定性良好。

技術領域

本發明涉及一種生物工程技術領域的質粒分子，具體涉及一種適用于產志賀毒素大腸桿菌實時熒光定量PCR檢測的質粒標準分子及其構建方法、定量方法和應用。

背景技術

產志賀毒素大腸桿菌是一種與公共衛生密切相關的致病性大腸桿菌，可引起出血性結腸炎、溶血性尿毒綜合癥等疾病。自1982年Riley等在美國首次分離該菌以來，英國、加拿大、日本和我國都相繼有產志賀毒素大腸桿菌暴發的報道。產志賀毒素大腸桿菌作為一種人畜共患病原菌，可以在畜禽中流行和傳播，并通過動物源性食品進行擴散。目前，國內診斷產志賀毒素大腸桿菌主要依靠細菌培養、生化反應(包括山梨醇一麥康凱瓊脂篩選等)和血清學鑒定。同時，采用志賀樣毒素檢測進行確證試驗。上述方法檢測周期長，操作繁瑣，往往達不到疫情控制的要求。而在分子水平方面，如PCR方法則可以快速、靈敏地檢測產志賀毒素大腸桿菌大腸桿菌。本文研制的產志賀毒素大腸桿菌大腸桿菌定量檢測用質粒分子是指一種含有產志賀毒素大腸桿菌的主要毒力因子stx1和stx2編碼基因序列片段的重組質粒分子標準物質。質粒標準分子在大腸桿菌核酸擴增(PCR)熒光檢測試劑盒中是很好的標準陽性物質替代物。質粒分子的優點主要是可以通過微生物進行大量培養，DNA易于擴增，所以可提供穩定含量的標準物質，并且純度較高；另外具有操作容易，穩定性高的優點。

在實際大腸桿菌實時熒光PCR時，各單位使用的多是自行設計構建的質粒DNA分子作為標準品，其中的目的基因特異性片段各不相同，同時缺乏統一的定值方法，質粒DNA分子定值準確度差，造成各實驗室之間的檢測結果差異極大，缺乏可比性。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于產志賀毒素大腸桿菌檢測的質粒標準分子及其應用。

本發明的第一方面，提供了一種檢測產志賀毒素大腸桿菌的試劑盒，所述試劑盒中包括：

標準分子，所述標準分子中含有SEQ ID NO.:1和/SEQ ID NO.:2所示的多核苷酸。

在另一優選例中，所述標準分子的序列如SEQ ID NO.:3或4所示。

在另一優選例中，所述試劑盒中還包括引物序列，所述引物序列用于特異性擴增SEQ ID NO.:1所示的序列，所述引物序列選自下組：

(1)SEQ ID NO.:5和SEQ ID NO.:6所示的引物序列；

(2)SEQ ID NO.:7和SEQ ID NO.:8所示的引物序列；和

(3)SEQ ID NO.:9和SEQ ID NO.:10所示的引物序列。

在另一優選例中，所述試劑盒中還包括引物序列，所述引物序列用于特異性擴增SEQ ID NO.:2所示的序列，所述引物序列選自下組：

(1)SEQ ID NO.:13和SEQ ID NO.:14所示的引物序列；

(2)SEQ ID NO.:15和SEQ ID NO.:16所示的引物序列；和

(3)SEQ ID NO.:17和SEQ ID NO.:18所示的引物序列。

在另一優選例中，所述試劑盒中還包括探針序列，所述探針序列分別針對產志賀毒素stx1基因和/或產志賀毒素stx2基因。

在另一優選例中，所述探針序列如SEQ ID NO.:21和/或SEQ ID NO.:22所示。