[發明專利]一種牛貝諾孢子蟲病巢式PCR檢測方法

在審

• 申請號: 201410605699.4
• 申請日: 2014-11-03
• 公開（公告）號: CN104388550A
• 公開（公告）日: 2015-03-04
• 發明（設計）人: 常巧呈;張艷;羅英花;王文濤;岳東梅;那璐;孫健;宋利國;薛瑞;王云光;李莉莉;王春仁
• 申請（專利權）人: 黑龍江八一農墾大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/90
• 代理公司: 沈陽技聯專利代理有限公司 21205
• 代理人: 張志剛

技術領域

????本發明涉及一種分子生物學檢測方法，特別是涉及一種牛貝諾孢子蟲病巢式PCR檢測方法。

背景技術

牛貝諾孢子蟲病（Besnoitiosis）是由貝氏貝諾孢子蟲(Besnoitia?besnoiti)寄生于牛眼、皮膚和生殖系統等部位引起的一種原蟲病。其包囊寄生于草食動物的皮下、結締組織、漿膜和呼吸道黏膜等處；主要侵害的部位是眼、皮膚和生殖系統，能引起母牛流產、產奶量下降、公牛精液質量下降，嚴重時引起死亡，對養牛業危害很大。給養殖業帶來了巨大的經濟損失。

????牛貝諾孢子蟲病分布廣泛，最初牛貝諾孢子蟲的病例報道常見于南非，以色列等國家，?近些年已經蔓延到歐洲、北美洲、非洲、大洋洲、東亞和中東等地區，并有進一步擴散的趨勢。其中歐盟的葡萄牙、西班牙、法國、德國和意大利等國家牛貝諾孢子蟲的流行區域的范圍和流行率不斷增加，給養殖業帶來了巨大的經濟損失。因此，2010年歐盟食品安全委員會（EFSA）將牛貝諾孢子蟲病列為重要的新興疾病，人們逐漸對牛貝諾孢子蟲病重視起來。在我國，主要發生在北京、內蒙古自治區、吉林省和黑龍江省，在黑龍江省呈地方性流行，主要分布在西部地區。因此，研究該病的檢測方法，對該病的早期快速確診和及時預防具有十分重要的意義。

目前，牛貝諾孢子蟲病的診斷主要有病原學檢查、血清學檢查和分子生物學診斷。病原學診斷方法是通過觀察包囊內的緩殖子以及血液中的速殖子形態結合臨床癥狀進行診斷；血清學方法主要有間接免疫熒光試驗（IFA）、酶聯免疫吸附試驗（ELISA?）和免疫印跡（Western?Blot）等方法，但這些方法應用的抗原都是貝諾孢子蟲的蟲體抗原，不利于大規模生產。牛貝諾孢子蟲病分子診斷方法主要是PCR方法，該方法是一種普通的PCR方法，敏感性較低，當感染初期，血液中的速殖子較少時容易引起漏檢。巢式PCR方法不但提高了PCR反應的特異性，同時也提高了反應的敏感性，能檢測較低拷貝數的模板。在蟲體基因組中，核糖體是一個由不同結構組成的重復單元，拷貝數量高，是設計引物進行PCR擴增的理想區域。其中核糖體轉錄間隔區（ITS）

的選擇性壓力比較小，其進化速率要比轉錄區的快而且能夠區分不同的物種，同時具有種內的相對保守性。因此，很多研究方法都是依據此進行設計。

本發明通過選取ITS序列設計特異性引物，運用巢式PCR方法對貝諾孢子蟲病進行檢測，在國內外尚且沒有報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種牛貝諾孢子蟲病巢式PCR檢測方法，該檢測方法具有敏感性高、特異性強的特點，用于貝諾孢子蟲病的早期檢測，對貝諾孢子蟲病的診斷和流行病學調查及防治提供依據，具有十分重要的意義。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：

一種牛貝諾孢子蟲病巢式PCR檢測方法，所述方法包括以下幾個步驟：

????步驟1）、基因組DNA提取：采用普通DNA提取方法提取貝諾孢子蟲DNA；

????步驟2）、第一輪PCR擴增：以步驟1）得到的樣品DNA為模板，采用蟲體ITS序列引物BN1/BN2經PCR擴增得到第一輪PCR產物；BN1序列為：5’-TGA?CAT?TTA?ATA?ACA?ATC?AAC?CCT?T-3’，BN2序列為：5’-TCC?TCC?GCT?TAT?TGA?TAT?GC-3’；

????步驟3）、第二輪PCR擴增：以第一輪PCR擴增產物為模板，設計貝諾孢子蟲特異性引物B3/B4經PCR擴增得到第二輪PCR擴增產物；BN3序列為：5’-CCA?CCT?CCT?CAC?TCT?GCT?AT-3’，BN4序列為：5’-TCC?TCT?GTG?TTC?ATT?ATT?CC-3’；?

????步驟4）、PCR擴增產物檢測：取5?μL第二輪PCR擴增產物，加入1μL的6×Loading?buffer，混勻后于1%瓊脂糖凝膠中，EB濃度為5?μg/mL，?100?V電壓下電泳30?min，凝膠成像系統觀察并拍照，存在約393bp的特異性條帶，則確定所檢測的病原為貝諾孢子蟲。

所述的一種牛貝諾孢子蟲病巢式PCR檢測方法，所述步驟2）?PCR反應體系25μL：10×ExTaq?Buffer?2.5μL，dNTP?Mixture（2.5mmol?each）2μL，上、下游引物（25mM）各0.5μL，模板DNA?1μL，Ex?Taq（5U/μL）0.2μL，加水至25μL。